牙本质来源生物材料在长期储存过程中的物理化学稳定性

《Journal of Functional Biomaterials》：Physicochemical Stability of Dentin-Derived Biomaterials During Long-Term Storage

　　

牙本质来源生物材料（dentin-derived biomaterials）是层次化胶原-矿物质复合材料，越来越多地被用作基于生物来源的骨再生支架。然而，拔除牙的长期储存对其物理化学完整性的影响仍不清楚。本研究使用拉曼光谱（Raman spectroscopy）评估了牙本质来源生物材料在长期冷藏储存（长达6年）后的稳定性。研究人员将拔除的人类牙齿通过三种制备系统（BonMaker、Tooth Transformer和Smart Dentin Grinder）处理，并将描述矿物质和胶原结构的拉曼衍生指数（Raman-derived indices）与新鲜拔除的对照组进行比较。在矿物质结晶度（mineral crystallinity）、碳酸盐取代（carbonate substitution）或胶原相关参数中未观察到随时间变化的改变，表明储存期间胶原-矿物质界面（collagen-mineral interface）得以保持。相反，观察到的差异主要与加工途径相关。Tooth Transformer和Smart Dentin Grinder的拉曼谱图与天然牙本质高度相似，而BonMaker则显示出矿物质含量降低和矿物质-基质平衡（mineral-matrix balance）改变，与其脱矿方案一致。这些发现表明，牙本质作为一种结构稳定的层次化复合材料，其内在的结构组织限制了随时间的物理化学降解。长期储存不会损害牙本质的完整性，支持其作为再生应用和未来牙库策略（tooth banking strategies）中可靠生物材料来源的用途。

**论文解读：牙本质来源生物材料在长期储存中的物理化学稳定性及加工依赖特性**

**研究背景、存在问题及研究意义**

牙本质来源生物材料（dentin-derived biomaterials, DDBs）是由I型胶原（type I collagen）与碳酸化羟基磷灰石纳米晶体（carbonated hydroxyapatite nanocrystals）构成的层次化胶原-矿物质复合材料，因其组成与骨组织高度相似，近年来在口腔颌面外科中作为自体生物支架材料用于骨再生日益受到关注。然而，尽管已有研究关注DDBs制备后的短期理化特性，但拔除牙在冷藏储存条件下长期存放（如数年）是否会影响其胶原-矿物质界面的完整性，进而改变其作为生物材料的性能，目前尚缺乏系统性证据。这一知识空白限制了牙库（tooth banking）策略在临床再生流程中的灵活应用。为此，本研究旨在通过拉曼光谱（Raman spectroscopy）评估长达6年冷藏储存对DDBs理化稳定性的影响，明确储存时长是否对材料完整性构成威胁，以及观察到的变化是否主要源于加工方式而非储存时间。研究论文发表在《Journal of Functional Biomaterials》。

**主要关键技术与方法概述**

研究采用48颗因牙周适应证拔除的人类牙齿，按拔除年份（2018–2024）分组（每组n=6），另设2025年新鲜拔除牙作为对照组。所有样本在拔除后经3%过氧化氢消毒、机械清洁后密封于灭菌袋中，于4°C冷藏储存，无脱水处理。储存后，样本经三种加工系统处理：BonMaker（BM，盐酸脱矿）、Tooth Transformer（TT，部分脱矿）和Smart Dentin Grinder（SDG，碱处理），分别代表化学改性、矿物主导和最小加工路径。处理后的牙本质颗粒经2.5%戊二醛固定后，使用配备785 nm激发激光的DXR-SmartRaman拉曼光谱仪进行非破坏性分析，采集200–3200 cm^-1范围光谱，经基线校正和向量归一化后计算六项拉曼衍生指数：矿物结晶度（Index I1，以磷酸盐ν₁带~960 cm^-1半高宽的倒数表示）、碳酸盐-磷酸盐比率（Index I2，1070 cm^-1/960 cm^-1）、相对矿物浓度（Index I3，960 cm^-1/1003 cm^-1）、矿物-基质比率（Index I4，960 cm^-1/1450 cm^-1）、胶原质量（Index I5，脯氨酸/羟脯氨酸强度比850 cm^-1/870 cm^-1）以及有机基质组织（Index I6，CH伸缩比2940 cm^-1/2880 cm^-1）。统计学分析采用Kruskal-Wallis检验及Dunnett事后比较（Bonferroni校正，α=0.008）。

**研究结果**

**3.1 拉曼光谱结果**
研究通过六项拉曼指数系统评估了牙本质作为层次化复合材料的时域稳定性。
- **矿物结晶度（I1）**：在所有储存年份（2018–2024）间，I1值变化极小。TT和SDG组数值接近天然牙本质对照组，而BM组结晶度持续低于其他组，表明加工方式而非储存时长影响该参数。
- **碳酸盐-磷酸盐比率（I2）**：所有储存期I2值保持稳定。TT和SDG组与对照组相当，BM组则显示较高碳酸盐取代，提示其脱矿处理改变了矿物组成。
- **相对矿物浓度（I3）**：组间差异显著。BM组数值明显低于TT、SDG及对照组，而TT和SDG在所有储存期均与天然牙本质紧密吻合。
- **矿物-基质比率（I4）**：趋势与I3一致。BM组显著低于其他组，TT和SDG组则维持与对照组无统计学差异，且未表现时间变化。
- **胶原质量（I5）**：组间差异较小，无时间趋势。TT和SDG组略低于对照组，BM组与天然牙本质相当。
- **有机基质组织（I6）**：所有加工组I6值均高于对照组，其中BM组最高。但各加工组内随储存时间无渐进变化。
总体而言，TT和SDG的拉曼谱图与天然牙本质高度相似，而BM因化学脱矿导致系统性的指数偏移。

**3.2 统计分析结果**
Dunnett检验（Bonferroni校正）确认：
- I1和I2：组间无显著差异（p>0.008），表明矿物结晶度和碳酸盐取代在各组间可比较。
- I3和I4：BM组与所有其他组（TT、SDG、对照）间存在高度显著差异（p≤0.002），证实BM路线降低了矿物含量并改变了矿物-基质平衡。TT、SDG与对照组间无显著差异。
- I5：对照组显著高于TT和SDG（p<0.008），但与BM无差异。
- I6：对照组显著低于所有加工组（p=0.001），TT与SDG间无差异。
统计结果强调，理化差异主要由加工方式驱动，储存时长未引入系统性的时间依赖性变化。

**讨论总结与研究结论**

讨论部分指出，本研究表明牙本质来源生物材料在长达6年的冷藏储存后，其矿物和有机组分的拉曼指数均未出现可测量的时间依赖性变化，反映出胶原-矿物质界面及水合介导的结构完整性得以保持。而观察到的差异主要归因于加工方案：TT和SDG保留了接近天然牙本质的层次化结构，BM因强酸脱矿导致矿物含量降低和基质比例改变。该发现支持牙本质可作为结构稳定的生物复合材料，其内在组织限制了理化降解。从转化医学角度，储存稳定性可促进牙库策略的灵活性，使拔除牙在加工前保持理化性质，但需进一步研究其对骨诱导潜能和体内性能的影响。研究局限性包括未直接评估力学性能和生物学响应，且拉曼光谱无法排除纳米尺度超微结构改变。未来需整合光谱、力学和生物学分析。

研究结论部分（翻译）：在本研究的局限性内，研究人员发现牙本质来源生物材料作为层次化胶原-矿物质复合材料，即使经过长达6年的冷藏储存，仍保持高度的物理化学稳定性。时间分辨拉曼光谱分析显示，矿物结晶度、碳酸盐取代、矿物-基质平衡以及胶原相关振动特征在观察期内保持稳定，表明在这些特定储存条件下，胶原-矿物质界面的分子完整性得以保存。需要指出，这些结论基于所分析的拉曼指数的灵敏度和范围。虽然数据显示分子水平上的结构完整性未因储存时长发生显著改变，但这种分子稳定性并不能完全反映宏观力学或长期生物学性能。观察到的支架理化特性主要受初始加工方法而非储存时长支配。从生物材料角度，这些结果为支持牙本质作为稳健的生物来源支架提供了有前景的分子基线。尽管这种稳定性可能有利于更灵活的临床工作流程并支持牙库方法的潜力，但这些分子指标应视为初步结果。需要进一步开展纵向研究，整合力学测试和生物学验证等多模态评估，以确认这些材料的长期临床相关性和功能表现。