《Gels》：Preparation of Stacked Polymyxin B-Functionalized Cryogels for Efficient Endotoxin Removal from Complex Biological Systems
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开发高效稳健的内毒素去除方法，对于保障噬菌体制剂及重组蛋白生物制品的安全性与功能性能至关重要。本研究采用堆叠凝胶浇铸策略结合羧甲基壳聚糖(CMCS)增强，构建了一种机械强度优异的PMB功能化低温凝胶。堆叠结构与CMCS增强的协同效应显著提升了孔壁稳定性与功能位
开发高效稳健的内毒素去除方法，对于保障噬菌体制剂及重组蛋白生物制品的安全性与功能性能至关重要。本研究采用堆叠凝胶浇铸策略结合羧甲基壳聚糖(CMCS)增强，构建了一种机械强度优异的PMB功能化低温凝胶。堆叠结构与CMCS增强的协同效应显著提升了孔壁稳定性与功能位点可及性，使其具备高内毒素吸附容量(1.88×106EU/g)和优异的可重复使用性(六次循环后去除率>90.30%)。该低温凝胶在复杂生物样品中也表现出有效的内毒素去除能力，在噬菌体制剂中实现>99.00%的去除率并提升噬菌体回收率，在重组蛋白溶液中实现>99.99%的清除率。上述结果凸显了一种在噬菌体应用及生物制药纯化领域中用于控制内毒素的有前景的策略。
论文解读：堆叠式多粘菌素B功能化低温凝胶高效去除复杂生物体系内毒素
研究背景与意义
在重组蛋白、抗体制剂及新兴的噬菌体制剂等生物制品的开发生产中，产品的安全性与纯度是核心质量属性。尤其在食品安全检测、水产养殖病害防控及细胞或动物模型研究中，痕量杂质会干扰实验准确性或引入安全风险。例如，水产养殖中噬菌体作为抗生素天然替代品大规模生产时，细菌裂解会释放大量内毒素（主要为革兰氏阴性菌外膜的脂多糖LPS），积累于终产品后可诱导水生生物应激甚至经食物链危害食品安全。同样，在ELISA分析中，重组抗体残留内毒素会升高背景信号导致假阳性。尽管发酵与下游纯化技术进步，但革兰氏阴性菌表达系统中的内毒素污染仍难消除。LPS的脂质A部分化学稳定性极高，耐热、耐pH及化学变性。各国监管机构（如FDA、EP）对注射用水及药物有严格内毒素限值（如注射用水<0.25–0.5 EU/mL，体内研究用重组蛋白常要求<0.1 EU/μg），噬菌体制剂专家共识建议≤250 EU/107PFU。真实生物基质（蛋白、核酸、多糖、脂质等）使去除更困难：噬菌体裂解液的高浓度DNA和细胞碎片竞争吸附位点；蛋白溶液的疏水区/电荷区屏蔽吸附位点；疫苗系统中的脂质纳米颗粒或病毒样颗粒与LPS非特异互作。现有方法包括阴离子交换色谱、膜过滤、双相萃取及亲和吸附等。其中多粘菌素B(PMB)功能化亲和材料因对LPS高特异性受关注。低温凝胶(Cryogel)是一类大孔聚合物材料，具互通孔结构、低流阻、高渗透性及高效传质。已有PMB功能化低温凝胶（如CG(HEMA-co-AM)@ECH@PMB）在模型蛋白系统中表现良好，但传统整体柱式制备常带来结构不均、孔分布不匀、孔壁塌陷及结构疲劳，损害吸附效率与重复使用性。本文发表于《Gels》，研究人员通过制备工艺与材料组成双重优化——堆叠式凝胶浇铸提升热质传递与结构均一性，引入亲水生物相容多糖羧甲基壳聚糖(CMCS)增强孔壁与稳定性——构建了机械强、结构完整、适于复杂体系处理的PMB功能化复合低温凝胶，系统评估其结构、吸附、复用性及复杂生物基质适用性，阐明堆叠架构、CMCS增强与PMB亲和互作的协同贡献。
主要关键技术方法概括
研究人员以丙烯酰胺(AM)、2-羟基乙基甲基丙烯酸酯(HEMA)为聚合单体，N,N′-亚甲基双丙烯酰胺(MBAm)为交联剂，引入烯丙基缩水甘油醚(AGE)提供初始环氧基，加入羧甲基壳聚糖(CMCS)增强，在预冷12孔板中?13°C低温聚合制备圆盘状堆叠前体CG(HEMA-co-AM(CMCS))。以环氧氯丙烷(ECH)在碱性与DMSO辅助下对富羟基骨架二次环氧活化得CG(HEMA-co-AM(CMCS))@ECH，再于pH 9.0、37°C将PMB共价偶联，乙醇胺封闭剩余环氧基，20%乙醇4°C保存得目标材料CG(HEMA-co-AM(CMCS))@ECH@PMB。表征采用Micro-CT、SEM、FT-IR、环氧基密度滴定、溶胀与大孔孔隙度测定。性能评估使用Tris-HCl缓冲液及五种模型蛋白溶液(BSA、HSA、Hb、LYS、OVA)以6 mL/min恒流灌注，测定内毒素去除率与蛋白回收率，六次吸附-洗脱再生循环考察复用性。实用样本包括实验室大肠杆菌表达系统制备的重组蛋白（AK、SCP、不同诱导温度的G20B与G37B）及来自青岛市场与污水厂的九株噬菌体制剂（VPP1R、HD1、WM004、MS1、MS2、MS3、IME18、MG16550、VB SEqdws 315），内毒素用鲎试剂盒定量，蛋白浓度BCA法，噬菌体滴度双层琼脂法。储存稳定性考察冻干塑封常温与20%乙醇4°C保存60天。
研究结果
2.1 CG(HEMA-co-AM)@ECH@PMB的Micro-CT表征
研究人员对既往整体柱PMB低温凝胶进行Micro-CT三维成像，发现虽具一定吸附性能，但制备、冻干、活化、配基偶联及反复吸附-解吸后仍存在结构异质性，表现为凝胶矩阵内孔分布不均，尤其整体柱中部局部致密化。这种异质性源于初始凝胶制备引入的本征缺陷（影响后续环氧化与配基固定效率）及反复灌流引起的机械疲劳与局部变形。因此需从组分设计与架构构型优化提升低温凝胶结构完整性。
2.2 堆叠式CG(HEMA-co-AM(CMCS))的制备与结构性能优化分析
传统整体柱低温凝胶体积厚大，低温聚合阶段基体内热质传递慢且空间不均，交联聚合反应不完全，三维网络骨架较疏松，机械强度不足，后续流体灌洗易骨架变形、孔结构失稳。研究人员改用堆叠式制备：将前体液滴加至预冷12孔板，恒温浴?13°C聚合得尺寸形貌均一的圆盘状低温凝胶片，经环氧活化与配基偶联后多层叠入空色谱柱，借助柱壁侧向约束形成准整体堆叠柱床。宏观与SEM显示所得堆叠凝胶外观饱满、冻干后中心无显著收缩。机制上，预冷12孔板增大反应体系比表面积，显著提升热质传递效率，使共聚同步均匀进行，从根本上消除不完全交联，减少超大孔或内部空隙，形成更均细孔结构。相比整体柱，堆叠架构提供更均一有序多孔骨架，增大后续环氧活化与配基偶联的固液界面面积。SEM进一步显示引入CMCS的CG(HEMA-co-AM(CMCS))干态孔壁明显增厚，暗示增强的机械稳健性。FT-IR保留AM-HEMA特征峰（1080 cm?1C–O–C，1650 cm?1酰胺I带，1545 cm?1酰胺II带），CMCS引入后酰胺II带与~3434 cm?1O–H伸缩振动增强，表明CMCS与聚丙烯酰胺链间氢键互作提升，证实CMCS成功掺入并增强分子间作用。优化活化偶联条件下，堆叠凝胶环氧基密度达41.17 μmol/g（较整体柱提升约19.32%），PMB配基密度提升约22.30%，归因于堆叠结构更大接触面积提升活化/偶联试剂效率。
2.3 堆叠CG(HEMA-co-AM(CMCS))的功能化与表征
堆叠前体通过两步化学修饰赋予内毒素吸附能力：先由聚合引入的AGE提供少量环氧基，再以ECH对丰富表面羟基在碱性下脱质子成烷氧中间体，亲核取代共价接枝大量环氧基得CG(HEMA-co-AM(CMCS))@ECH，避免单纯提高AGE破坏机械性（>20%总单体质量易致网络不稳、孔塌甚至不凝胶）。再利用环氧基与PMB氨基亲核进攻共价固定PMB得CG(HEMA-co-AM(CMCS))@ECH@PMB。吸附能力主因固定化PMB对LPS脂质A的高特异亲和，基于该分子互作实现选择性识别与稳定吸附。
2.4 Tris-HCl缓冲液与模型蛋白溶液中的内毒素吸附评价
研究人员以Tris-HCl与五种模型蛋白溶液灌注评估。堆叠CMCS凝胶与整体柱趋势相似但更高效：Tris-HCl中内毒素去除率达99.70%；五种蛋白溶液中堆叠版均优于整体柱。堆叠凝胶内径由13 mm增至22.45 mm，最大流速更高；同质量下柱高降低缩短样品-凝胶接触时间，理论上略降吸附，但因更高环氧与PMB负载补偿并反超。蛋白回收也改善（图6b），溶菌酶(LYS)单次处理洗脱回收达89.42%，归因于堆叠结构缩短蛋白-基质接触减少非特异吸附。最大吸附容量达1,883,466.32 EU/g，较整体柱提升约25.22%，居当前内毒素吸附剂高位，高于纤维素微球或电纺纳米纤维基PMB材料及其他配基（如PEI接枝微球、壳素基纳米纤维膜），归功于堆叠浇铸与CMCS增强协同提升孔壁比表面积与PMB负载。复用性上，六次循环后堆叠CMCS凝胶内毒素去除率略降但仍>90.00%（整体柱第6次降至74.12%），蛋白回收稳定、无结构塌陷与二次污染。CMCS增强孔壁为主要承力框架，缓解循环吸附-解吸应力，抑制薄壁屈曲断裂；偏大孔径助传质并缓减孔堵，共筑长期动态稳定性。
2.5 实际样本中的内毒素去除评价
重组蛋白样本：选用实验室大肠杆菌系统表达的四类蛋白（AK~42 kDa、SCP~24 kDa、不同低温诱导的G20B与G37B），未纯化粗样灌注。三次循环后八组样本内毒素均降至2.5 EU/mL以下，去除率>99.99%（传统亲和/多糖材料在复杂体系中常70–90%），蛋白回收除SCP外七组>66.44%（SCP等电点~4.67、较强疏水性，与PMB非特异互作多，回收仅52.42%）。同类型蛋白(G20B/G37B)随浓度升高回收略降，因高浓度更易非特异吸附、轻微孔堵及蛋白-LPS复合物形成。处理后内毒素均<1 EU/mg，满足体外细胞实验安全要求。
噬菌体制剂：九株噬菌体单次处理内毒素去除率均>99.00%。滴度变化显示回收率VPP1R 27.27%、HD1 43.24%、WM004 40.43%、MS1 30.00%、MS2 38.96%、MS3 42.03%、IME18 42.86%、MG16550 44.64%、VB SEqdws 315 52.17%，低于超滤法但内毒素清除更优，传统凝胶过滤与活性炭吸附综合性能不及。回收降低可归于噬菌体与基质非特异吸附（静电/疏水）及部分噬菌体与内毒素成复合物被共吸附。定量显示处理后内毒素/噬菌体比值分别为2.02 EU/107PFU(HD1等各株具体值文中有列)，均远低于《中国噬菌体治疗专家共识》建议≤250 EU/107PFU，安全性高。
2.6 储存条件对低温凝胶性能的影响
20%乙醇4°C保存60天，内毒素吸附效率仅降0.90%；冻干塑封20°C保存60天因内部脱水、再水合能力下降降至96.52%。20%乙醇维持结构稳定、抑制微生物、保湿并轻度固定凝胶，是堆叠CG(HEMA-co-AM(CMCS))@ECH@PMB的优选储存策略，可维持至少60天性能。
讨论与结论翻译总结
研究人员通过将独立制备的低温凝胶单体组装为堆叠架构，并结合羧甲基壳聚糖掺入，构建了结构增强的PMB功能化低温凝胶。该设计有效缓解内部聚合应力，增强孔壁强健性，大幅提升对复杂生化环境的耐受性。优化凝胶最大内毒素吸附容量达1,883,466.32 EU/g，六次再生循环后保持>90.30%吸附效率，复用性与结构稳定性优异。实际应用中，噬菌体制剂中>99.00%内毒素去除同时保持较高噬菌体回收；重组蛋白纯化三周期>99.99%内毒素清除，达细胞实验严苛限值。综上，CMCS增强堆叠低温凝胶兼具优异亲和性能、机械强韧与环境耐受性，作为高效内毒素纯化平台在噬菌体制剂、生物制药生产及其他需严控内毒素的应用中具重要潜力。
