负载扇贝活性肽(Scallop Active Peptides, SAPs)的羧甲基壳聚糖(Carboxymethyl Chitosan, CMCS)/氧化海藻酸钠(Oxidized Sodium Alginate, OSA)水凝胶用于促进皮肤创面愈合与组织再生

《Gels》：A Scallop Active Peptide-Incorporated Carboxymethyl Chitosan/Oxidized Sodium Alginate Hydrogel for Accelerating Skin Wound Healing and Tissue Regeneration

　　

本研究开发了一种基于高碘酸钠氧化法制备的氧化海藻酸钠(Oxidized Sodium Alginate, OSA)与羧甲基壳聚糖(Carboxymethyl Chitosan, CMCS)基质复合、并负载具有抗氧化及促再生活性的海洋源生物活性成分——扇贝活性肽(Scallop Active Peptides, SAPs)的新型复合水凝胶。希夫碱(Schiff base)反应驱动的动态共价网络构建通过傅里叶变换红外光谱(FT-IR)和1H-核磁共振(1H-NMR)表征证实。该水凝胶表现出良好的理化性质，包括剪切稀化行为、显著的自愈合能力，以及有效模拟细胞外基质(Extracellular Matrix, ECM)的均匀多孔微结构。体外评估显示其具有优异的生物相容性和促血管生成潜能，体现为增强的人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVECs)迁移和成管能力。在大鼠全层皮肤缺损模型中，CMCS/OSA/SAPs水凝胶显著加速创面闭合，促进再上皮化和有序胶原沉积。此外，免疫组化分析证实其上调血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF)和α-平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin, α-SMA)表达，同时降低炎症水平(诱导型一氧化氮合酶(inducible Nitric Oxide Synthase, iNOS)减少)，表明其具有强效的组织再生和免疫调节功能。综上，本工作提出了一种集抗氧化、抗炎和组织再生性能于一体的多功能水凝胶系统，为深部创面愈合提供了有前景的策略，并凸显了海洋源生物活性蛋白/肽在先进生物医学材料开发中的重要潜力。

《Gels》刊载的本研究针对全层皮肤缺损创面氧化应激严重、血管化不足导致愈合停滞的临床难题展开。传统敷料易致二次损伤且无法维持湿润环境；常规天然高分子水凝胶存在力学强度弱、缺乏生物活性引导组织再生等局限；羧甲基壳聚糖(CMCS)与氧化海藻酸钠(OSA)形成的希夫碱交联网络虽具自愈合性但单独无促细胞增殖与组织再生活性；创面过度活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)累积可延长炎症期、阻碍进入增殖期。为此研究人员将具抗氧化与促再生作用的扇贝活性肽(Scallop Active Peptides, SAPs)引入CMCS/OSA动态交联体系，构建CMCS/OSA/SAPs复合生物活性水凝胶，旨在清除过量ROS、下调炎症、促血管新生及胶原沉积以加速修复，并系统评价其理化性质、体外生物活性及大鼠全层皮肤缺损模型体内疗效。

主要关键技术方法：研究人员采用高碘酸钠氧化海藻酸钠(Sodium Alginate, SA)制备OSA；以CMCS与OSA通过希夫碱反应形成水凝胶，SAPs于交联前加入前体溶液实现包封。通过FT-IR与¹H-NMR表征OSA及水凝胶结构；扫描电镜(Scanning Electron Microscope, SEM)观察微观形貌；旋转流变仪进行应变扫描、频率扫描及阶跃应变测试评估流变学与自愈合性；称重法测溶胀率。采用人脐静脉内皮细胞(HUVECs)进行CCK-8、活/死荧光染色、划痕实验、Matrigel成管实验评估细胞相容性与促血管生成；DPPH^+•、ABTS^+•及•OH自由基清除实验测定体外抗氧化活性。溶血实验评价血液相容性。建立SD(Sprague-Dawley)大鼠直径10 mm全层皮肤缺损模型（n=6/组），设空白对照、CMCS/OSA组及CMCS/OSA/SAPs组，术后观察14天创面愈合，取材行苏木精-伊红(Hematoxylin and Eosin, H&E)染色、Masson三色染色、CD31与α-SMA免疫组化(Immunohistochemistry, IHC)染色及VEGF与iNOS免疫荧光(Immunofluorescence, IF)染色分析。

研究结果

2.1. Preparation and Characterization of OSA（OSA的制备与表征）：通过FT-IR在OSA谱图1730 cm^?1处出现醛基羰基对称伸缩振动新吸收峰；¹H-NMR中OSA在δ=4.30–5.40 ppm出现氧化糖残基H6/H7质子信号，δ=5.61及5.84 ppm归属为新生成半缩醛质子，证实高碘酸钠氧化SA成功制备含醛基的OSA。

2.2. Preparation and Characterization of Hydrogels（水凝胶的制备与表征）

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  2.2.1. Macroscopic Morphological Analysis（宏观形态分析）：CMCS/OSA无色透明均一；CMCS/OSA/SAPs因SAPs两亲性带入微量微气泡但不影响结构完整性，二者宏观均匀无相分离。
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  2.2.2. Microscopic Morphological Analysis（微观形态分析）：SEM显示两组均有高度互联均匀三维多孔网络，载入SAPs后保持多孔性仅孔径略变，可有效模拟细胞外基质(ECM)并为细胞黏附、迁移、增殖提供支架，高比表面积赋予优良吸液保液能力。
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  2.2.3. Rheological Results（流变学结果）：小振幅应变下储能模量G′大于损耗模量G″，具稳定弹性三维网络；CMCS/OSA临界应变361%，CMCS/OSA/SAPs为227%（肽链空阻使连续大分子排列受限致临界应变略降），仍远高于人体皮肤生理形变（50–100%），满足创面敷料力学安全裕度。频率扫描（0.1–100 rad/s）G′始终高于G″，网络稳定。阶跃大/小应变循环G′与G″迅速恢复，宏观两切断面接触后可融合为整体，证明希夫碱键可逆断裂重连赋予自愈合能力，SAPs掺入未损害该性能。
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  2.2.4. Analysis of Swelling（溶胀分析）：前10 h为快速吸水溶胀期，后趋平衡。CMCS/OSA最大溶胀率约2173.46%，CMCS/OSA/SAPs约1903.58%（肽增强分子间作用使网络稍致密限制水扩散），均在理想敷料范围，可吸收过多渗出液并保持湿润微环境。

2.3. Biocompatibility and Hemocompatibility（生物相容性与血液相容性）：CCK-8与活/死染色显示两组浸提液培养HUVECs 24 h与48 h细胞活力均超对照组，CMCS/OSA/SAPs组48 h达130.64±2.25%，促细胞增殖效果最显著。溶血实验各组溶血率远低于5%国际安全阈值，不引致红细胞溶解，具优良血液相容性。

2.4. In Vitro Biological Evaluation（体外生物学评价）

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  2.4.1. Cell Migration Results（细胞迁移结果）：划痕实验24 h与48 h CMCS/OSA/SAPs组成像区迁移率分别达63.4±1.44%与85.2±1.35%，48 h近完全闭合，明显优于其余组，证实复合水凝胶有效刺激内皮细胞迁移。
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  2.4.2. Angiography Results（血管生成结果）：HUVECs在Matrigel上培养12 h，CMCS/OSA/SAPs组形成密集完整毛细血管样网络，节点数与总管长显著高于对照组，证明SAPs与仿生多孔基质协同促体内血管新生潜力。
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  2.4.3. Antioxidant Activity（抗氧化活性）：随SAPs浓度升高，复合水凝胶对DPPH^+•、ABTS^+•及•OH清除率递增，峰值分别为56.42±0.92%、79.85±1.73%与41.21±2.53%，可清除过量ROS减轻氧化损伤。

2.5. Hydrogel's Ability to Promote Wound Healing（水凝胶促创面愈合能力）：SD大鼠全层皮肤缺损模型，第3天CMCS/OSA/SAPs组愈合率63.42%（p<0.05 vs 对照组42.18%），第14天达97.95%近完全闭合，其余组存残留缺损，复合水凝胶显著加速再上皮化与收缩。

2.6. Histological Analysis of Regenerated Wound Tissues（再生创面组织学分析）

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  2.6.1. Hematoxylin and Eosin Staining（H&E染色）：第7天CMCS/OSA/SAPs组上皮层更连续增厚，真皮厚度128.93 μm显著高于空白与单纯CMCS/OSA组(p<0.05)；第14天新生表皮完整且表皮架构更致密，证实促再上皮化与组织重塑。
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  2.6.2. Masson's Trichrome Staining（Masson三色染色）：第7天CMCS/OSA/SAPs组胶原沉积率45.19%（空白组17.33%，p<0.001），蓝色胶原纤维面积最大且排列规整，证明有效促进胶原积累与成熟沉积。
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  2.6.3. CD31 Immunohistochemical Staining（CD31免疫组化染色）：CMCS/OSA/SAPs组CD31阳性面积百分比8.52%，显著高于其余组(p<0.05)，代表创面组织内新生微血管密度最高，与体外成管趋势一致。
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  2.6.4. α-SMA Immunohistochemical Staining（α-SMA免疫组化染色）：CMCS/OSA/SAPs组α-SMA表达7.2%（空白3.1%，p<0.05），可见棕黄色管状结构，提示肌成纤维细胞增多、新生血管成熟度与创面收缩能力增强。
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  2.6.5. iNOS Immunofluorescence Staining（iNOS免疫荧光染色）：第7天CMCS/OSA/SAPs组iNOS红色荧光最弱，定量显著低于空白对照(p<0.05)，表明水凝胶下调M1型巨噬细胞相关促炎因子，减轻创面炎症微环境。
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  2.6.6. VEGF Immunofluorescence Staining（VEGF免疫荧光染色）：CMCS/OSA/SAPs组第7天VEGF相对荧光强度375.2%，显著高于其余组(p<0.05)，证实上调VEGF表达以促进血管发生。

2.7. Mechanistic Insights into Wound Healing Promotion（促愈合机制探讨）：研究人员指出SAPs主要通过抗氧化调控（清除过量ROS改善氧化应激微环境）、炎症调节（下调iNOS缩短炎症期）、促血管生成（上调VEGF、增加CD31与α-SMA表达诱导新生血管成熟）及组织重塑（加速再上皮化与有序胶原沉积）多途径协同促进全层皮肤缺损修复。

讨论与结论翻译（Conclusions部分浓缩翻译）：本研究通过高碘酸钠氧化法制备OSA，与CMCS氨基经希夫碱反应构建含动态共价键的三维网络水凝胶，FT-IR和¹H-NMR证实交联结构；SEM显示均匀互联多孔形态仿生ECM；流变学证明优越类固体弹性与自愈合能力。体外HUVECs实验证实优良生物相容性（细胞活力>90%）及SAPs促细胞迁移与成管；SD大鼠全层皮肤缺损模型中CMCS/OSA/SAPs水凝胶第14天愈合率约96%（原文数据97.95%），加速创面闭合，H&E与Masson染色示再上皮化加快及有序胶原沉积；IHC与IF验证CD31(8.52%)、α-SMA(7.2%)与VEGF表达上调，iNOS降低，表明复合水凝胶协同发挥抗炎与再生作用。未来需质谱鉴定SAPs活性肽序列，借助转录组/蛋白质组阐明分子信号通路，并引入其他动态共价键优化生物活性肽响应释放动力学以适应复杂创面。