人类肠道相关淋巴组织图谱揭示B细胞的免疫调节相互作用

《Science Immunology》：Atlas of human gut-associated lymphoid tissue reveals immunomodulatory interactions of B cells

　　

肠道相关淋巴组织（GALT）是组织结构化的淋巴组织，持续对从肠腔采样的抗原（包括完整细菌）作出反应。由此产生的免疫球蛋白A（IgA）浆细胞反应扩散以调节细菌种群并介导肠道免疫稳态。GALT在先天性边缘区B细胞群体的发育中发挥作用，并与B细胞介导的溃疡性结肠炎（UC）严重程度和治疗反应有关。通过应用整合多组学方法，研究人员鉴定了B细胞亚群的关键空间解析相互作用，包括双阴性2型（DN2）B细胞的广泛调节特征，这些B细胞具有在富含微生物的黏膜内维持稳态的潜力。相比之下，UC中的GALT在B细胞亚群的组成和空间分布上发生扭曲，与健康GALT相比，这些B细胞亚群的免疫调节潜力发生了改变。因此，研究人员确定了战略定位的B细胞作为人类肠道免疫平衡介质的相互作用。

### 论文解读：人类肠道相关淋巴组织B细胞的免疫调节相互作用及在溃疡性结肠炎中的失调

#### 研究背景与目的
肠道相关淋巴组织（Gut-associated lymphoid tissue, GALT）是位于肠道微生物群与宿主之间的结构化淋巴组织，其通过滤泡相关上皮（Follicle-associated epithelium, FAE）持续从肠腔采样抗原（包括完整细菌），并将抗原递送至上皮下穹窿（Subepithelial dome, SED）。随后，B细胞反应（包括T细胞依赖和非T细胞依赖途径）产生免疫球蛋白A（Immunoglobulin A, IgA）浆细胞，这些细胞迁移至固有层（Lamina propria, LP）并分泌IgA，从而调节微生物群组成并维持肠道免疫稳态。此外，GALT还参与先天性边缘区B细胞（Marginal zone B, MZB）的成熟，这些细胞识别具有重复亚单位结构的抗原。然而，尽管GALT环境富含天然配体，采样的微生物通常不会驱动急性炎症，表明存在维持稳态的调控机制。溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis, UC）是一种炎性肠病，阑尾（富含GALT）在UC发病中具有特殊作用：早期阑尾切除术可能具有保护性，而UC患者阑尾口周围观察到“红色斑块”。GALT中B细胞亚群的失调可能与UC的严重程度和治疗反应相关。因此，理解B细胞在GALT中如何通过细胞间相互作用维持免疫稳态，以及这些相互作用在UC中如何被破坏，对于阐明肠道炎症机制至关重要。

#### 研究方法与结论
本研究通过整合多组学方法，分析了健康人和UC患者的阑尾组织（GALT主要部位），揭示了B细胞亚群的空间分布和免疫调节相互作用。研究发现，双阴性2型（Double negative 2, DN2）B细胞在SED区域富集，并表达CD86、颗粒体蛋白前体（Progranulin, GRN）和EB病毒诱导基因3（Epstein-Barr virus-induced gene 3, EBI3）等免疫调节分子，通过与其配体（如CTLA4、肿瘤坏死因子受体（TNFR）和IL-27受体亚基）相互作用，维持GALT微环境的稳态。在UC患者中，B细胞亚群的组成和空间分布发生改变，DN2细胞失去其近上皮定位，CD86表达下调，而GRN和EBI3表达增加，这些变化可能导致局部免疫调节失衡，促进炎症。论文发表在《Science Immunology》。该研究首次构建了人类GALT中B细胞相互作用的时空图谱，阐明了B细胞在肠道免疫调节中的关键作用，并为UC的发病机制提供了新见解。

#### 主要技术方法（不超过250字）
研究人员使用了以下关键技术：
1. **空间转录组学（CosMx平台）**：对7例健康人阑尾福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）切片进行1000重探针空间基因表达分析，通过细胞分割和谱系分类（基于与已发表单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据的锚定转移），可视化不同免疫细胞谱系（B细胞、T细胞、髓系细胞等）的空间分布。
2. **CITE-seq（联合转录组和表位测序）**：从3例健康成人阑尾中分选CD19⁺ B细胞，使用寡核苷酸标记抗体检测细胞表面蛋白（ADT），结合10x Genomics 5'单细胞测序，鉴定B细胞亚群（包括DN2、生发中心细胞、记忆B细胞等），并计算其差异表达基因。
3. **成像质谱流式（IMC）结合RNAscope**：对FFPE切片进行IMC（含金属标记抗体）和RNAscope原位杂交（检测CD86、GRN、EBI3等mRNA），验证基因和蛋白表达及细胞间邻近性。
4. **免疫荧光（IF）和共聚焦显微镜（CM）**：使用荧光抗体确认CD86、GRN和EBI3蛋白在B细胞中的共定位。样本来源：健康阑尾来自器官捐献者和手术标本（12例，其中7例用于CosMx）；UC样本来自4例因严重UC行右半结肠切除术患者的阑尾。

#### 研究结果
**1. 空间转录组学实现GALT中细胞谱系的可视化**
通过CosMx平台对7例健康阑尾组织进行空间转录组分析，整合已发表的成人阑尾scRNA-seq参考数据，将每个细胞分配到特定谱系（B细胞、T细胞、髓系细胞、内皮细胞、间充质细胞、浆细胞和上皮细胞）。空间可视化显示B细胞和T细胞富集于同型区域（如淋巴滤泡），而髓系细胞分散分布于不同谱系区域。邻近性分析表明，所有谱系均倾向于与自身细胞相邻，其中B细胞与其他谱系呈负邻近性，提示B细胞主要存在于B细胞富集区。

**2. 数据整合实现CosMx图像中B细胞亚群的鉴定**
由于CosMx仅包含1000个探针，不足以直接区分B细胞亚群，研究人员生成了健康阑尾B细胞的CITE-seq数据集（3个生物重复），通过锚定转移将B细胞亚群标签（包括na?ve、激活na?ve（aNAV）、生发中心（GC）细胞（中心母细胞和中心细胞）、双阴性2型（DN2）、边缘区B细胞（MZB）、类别转换记忆B细胞、IgM-only B细胞、浆母细胞等）映射到CosMx的B细胞上。空间可视化显示DN2细胞主要位于SED区域，而GC细胞呈典型明区-暗区分布。统计测试发现，浆母细胞与浆细胞、DN2细胞与髓系细胞呈显著正邻近性。

**3. 在CosMx数据集中鉴定的GALT中B细胞的细胞相互作用**
基于细胞邻近网络（边），利用CellTalkDB配体-受体数据库，计算B细胞亚群与其他谱系细胞间的相互作用强度。结果显示，SED区域具有最高的相互作用强度。在B细胞亚群中，aNAV和DN2细胞具有最高的相互作用强度，但与其他亚群相比，DN2细胞的边数较少（因其在SED局部富集）。DN2细胞作为信号源或靶点，与CD4⁺ T细胞、CD8⁺ T细胞、间充质细胞和髓系细胞发生强相互作用。通路分析显示这些相互作用主要涉及细胞因子信号、白细胞激活、细胞迁移和趋化。例如，DN2细胞表达的IL16与CD4⁺细胞的CD4分子相互作用，但IL16并非DN2特异性标志物。

**4. B细胞亚群特异性标志物参与细胞间相互作用**
进一步过滤仅包含CITE-seq确定的B细胞亚群标志基因的配体-受体对。DN2细胞的特异性相互作用包括：TNFRSF13B（TACI）与髓系细胞TNFSF13B（BAFF）相互作用（支持T非依赖IgA类别转换）；CD86与CTLA4⁺ CD4 T细胞相互作用；GRN与髓系细胞及T细胞上的TNFR（TNFRSF1A/B）相互作用；EBI3与IL27RA/IL6ST相互作用。其他亚群如na?ve B细胞通过LTA与TNF受体维持淋巴组织结构；MZB细胞通过NOTCH2与间充质DLL1相互作用（提示发育依赖）；记忆B细胞具有ITGB1相关相互作用。

**5. DN2细胞表达CD86、GRN和EBI3基因和蛋白**
通过IMC（含RNAscope探针）和IF/CM验证：在健康阑尾GALT的SED区域，DN2细胞（共表达FcRL4和ITGAX/CD11c）同时表达CD86 mRNA和蛋白，其邻近存在CTLA4⁺ CD4 T细胞。GRN mRNA由DN2细胞表达，其结合配体TNFRSF1A/1B在SED的CD68⁺髓系细胞、CD4⁺和CD8⁺ T细胞上表达；IF确认B细胞表达颗粒体蛋白。EBI3 mRNA由DN2细胞和生发中心中心细胞表达，但IL27（p28）和IL12A（p35）未被检测到；IF/CM确认B细胞在SED中表达EBI3蛋白。这些结果证实DN2细胞通过CD86-CTLA4、GRN-TNFR和EBI3-IL27RA/IL6ST等相互作用发挥免疫调节功能。

**6. GALT中B细胞维持稳态并在UC中失调**
通过对4例严重UC患者阑尾与4例健康阑尾的IMC比较，发现UC中B细胞谱系邻近性显著改变：B细胞和T细胞更易相互邻近（失去分区），PCA分析显示UC样本邻近性组成高度异质性。DN2细胞在UC中不再集中于近上皮的SED区域，而是弥散分布于滤泡中（最小距离上皮细胞分析证实）。在UC中，B细胞表达的CD86减少，而GRN和EBI3在近上皮B细胞中表达丰富（IF确认）。因此，B细胞在健康GALT中通过空间定位的免疫调节相互作用维持稳态，而在UC中，这些相互作用被破坏（亚群分布改变、调节标志物表达异常），可能促进炎性肠病的发生。

#### 讨论与结论总结
本研究通过多模态数据整合（CITE-seq、空间转录组学、IMC等），生成了人类GALT中B细胞相互作用的空间和功能图谱。研究发现，SED区域是B细胞相互作用最强的区域，其中DN2 B细胞通过表达CD86、GRN和EBI3等免疫调节分子，与其邻近的CTLA4⁺ T细胞、表达TNFR的髓系细胞和T细胞以及表达IL27RA/IL6ST的细胞相互作用，形成抑制性微环境，从而在病原相关分子模式丰富的环境中维持淋巴组织稳态，允许慢性B细胞反应而不诱导炎症。这些免疫调节作用部分已有体内小鼠模型和体外人类细胞研究的先例（如TACI-BAFF通路参与T非依赖IgA类别转换）。此外，FcRL4（抑制性受体）在SED和FAE的DN2细胞中高表达，进一步强调了该抗原富集微环境中的免疫抑制特征。

在UC中，正常的细胞相互作用被破坏：B细胞和T细胞失去分区，DN2细胞失去其近上皮位置，CD86表达缺失，而GRN和EBI3被B细胞大量分泌。这些改变可能反映了炎症反应或代偿性抑制尝试。研究局限性包括仅分析B细胞及其邻近相互作用，且UC样本局限于严重疾病阶段。尽管如此，本研究强调了B细胞作为免疫调节因子的重要性，其失调可能参与肠道炎症。**研究结论翻译**：因此，研究人员确定了人类肠道中战略定位的B细胞作为免疫平衡介质的相互作用。在健康GALT中，B细胞（尤其是DN2细胞）通过其免疫调节特性维持微环境稳态；而在UC中，B细胞亚群的组成和空间分布扭曲，免疫调节潜力改变，导致局部免疫失调，可能促进炎症性肠病的发生。