细胞毒性CD39+肿瘤相关NK细胞对肺癌中NKG2A阻断的反应

《Science Immunology》：Cytotoxic CD39+ tumor-associated NK cells respond to NKG2A blockade in lung cancer

　　

自然杀伤细胞（NK cell）靶向免疫治疗正在兴起，然而肿瘤浸润NK细胞的分化和功能状态仍知之甚少。利用来自非小细胞肺癌（NSCLC）患者的配对单核RNA和ATAC测序（single-nucleus RNA and ATAC sequencing），研究人员解析了瘤内NK细胞的转录和表观遗传景观。研究人员鉴定了两个以ITGAE（CD103）和ITGA1（CD49a）表达为标志的肿瘤相关NK（tumor-associated NK, taNK）细胞亚群，这些细胞在保留细胞毒功能的同时表现出组织驻留和功能障碍的特征。轨迹和调控子分析揭示了由炎症驱动的从早期颗粒酶K（GZMK）⁺NK细胞向以干扰素刺激基因（ISG）程序为特征的ENTPD1⁺（CD39⁺）效应状态的转变。功能分析确定CD39⁺ taNK细胞为主导性细胞毒NK细胞群体，具有优越的杀伤能力，且这种能力可通过NKG2A阻断进一步增强。该研究为NSCLC中NK细胞分化提供了机制性见解，并确立了CD39⁺ taNK细胞作为免疫治疗的可靶向效应群体。

肺癌是全球癌症相关死亡的首要原因，其中非小细胞肺癌（NSCLC）约占85%，尽管基于T细胞的免疫治疗已改善部分患者生存，但持久应答有限，亟需新的治疗策略。自然杀伤细胞（NK cell）因其抗肿瘤潜能而备受关注，其在瘤内的丰度与多种癌症预后改善相关，并可预测NSCLC中免疫检查点阻断（ICB）的疗效。然而，肿瘤浸润NK细胞的分化状态、基因调控网络（GRN）及功能异质性仍不清楚。为填补这一空白，研究人员对11例初治NSCLC患者（7例肺腺癌LUAD，4例肺鳞癌LUSC）的肿瘤标本进行配对单核RNA测序（snRNA-seq）和转座酶可及染色质测序（snATAC-seq），结合流式细胞术、空间转录组学、体外功能模型及患者来源肿瘤碎片（PDTF）平台，系统解析了瘤内NK细胞的表观遗传与转录景观。研究发现了两类肿瘤相关NK（taNK）细胞亚群，其中CD39⁺ taNK细胞是主要的细胞毒效应群体，其杀伤能力可通过NKG2A阻断进一步增强。该研究确立了CD39⁺ taNK细胞作为NSCLC免疫治疗的可靶向效应群体，为下一代NK细胞免疫疗法提供了新靶点。该论文发表在《Science Immunology》。

主要关键技术方法：研究人员采用10x Genomics Multiome平台对11例初治NSCLC患者（LUAD n=7；LUSC n=4）的肿瘤切除标本进行配对snRNA-seq和snATAC-seq，通过加权最近邻（WNN）整合多模态数据，使用SCENIC+推断增强子驱动的GRN，应用MultiVelocity进行轨迹分析。蛋白水平验证通过独立队列（n=15肿瘤、13癌旁、12外周血）的流式细胞术及10x Genomics Xenium空间转录组学完成。功能研究采用健康供者PBMC来源NK细胞与IL-15、TGF-β和A549肿瘤细胞共培养的体外taNK诱导模型，以及 NSCLC患者肿瘤碎片（PDTF）平台进行NKG2A阻断实验。

**结果**

* **人肺癌NK细胞表现出显著异质性**：通过整合snRNA-seq和snATAC-seq数据，研究人员在29,890个高质量NK细胞中鉴定出NK1、NK2、NK3及ILC1、ILC3等主要亚群，其中NK3细胞进一步分为NK3\_GZMK、NK3\_CRTAM和NK3\_ENTPD1三个亚群，后两者表达组织驻留标志（ITGAE、ITGA1）和功能障碍相关基因。

* **跨模态分析提示NK细胞亚群的不同表观遗传起源**：通过独立聚类RNA和ATAC数据并与WNN整合群比较，发现NK3\_CRTAM和NK3\_ENTPD1对应不同的染色质状态，表明这两个亚群具有不同的表观遗传谱系起源。

* **多样的GRN和转录谱揭示NSCLC中NK细胞亚群的功能特化**：SCENIC+分析显示NK3\_ENTPD1细胞富集增殖（E2F）、功能障碍（NR4A1）和适应性免疫（IRF4）相关的GRN；NK3\_CRTAM细胞则富集免疫抑制（NR3C1）、成熟（PRDM1）和组织驻留（RUNX2）相关GRN。两个taNK亚群均高表达组织驻留、适应性和功能障碍相关基因。

* **具有组织驻留和功能障碍特征的NK细胞在肺肿瘤组织中富集**：将NSCLC数据与50例非肿瘤肺NK细胞数据整合，发现一个仅在肿瘤中存在的NK3簇（taNK3），其高表达ITGAE、ITGA1和ENTPD1。基因集富集分析（GSEA）证实taNK细胞显著富集肺组织驻留、功能障碍和CD8组织驻留记忆T细胞（TRM）特征。

* **多参数分析验证了taNK细胞的身份**：流式细胞术证实CD103⁺CD49a⁺ NK细胞在肿瘤中富集，且高表达CCL5、GZMA、NKG2A、CD39等蛋白。Xenium空间转录组学显示taNK细胞共表达ITGAE、ITGA1和NKG7，主要分布在肿瘤核心和侵袭边缘。

* **功能分析揭示肿瘤相关NK细胞的强效应身份**：在NSCLC肿瘤消化细胞中，CD103⁺CD49a⁺ taNK细胞经IL-12、IL-15、IL-18刺激后CD107a、GZMB和Ki67的诱导倍数更高，提示其对炎症细胞因子敏感。体外taNK模型（IL-15+TGF-β+A549）诱导的CD103⁺CD49a⁺ NK细胞对A549-β2mKO靶细胞表现出增强的杀伤能力。在TCGA LUAD队列中，taNK特征高表达与总生存期改善相关（HR=0.237，P=0.0022），并在抗PD-1治疗有持久临床获益的NSCLC患者中富集。

* **ISGs和炎症相关调控子驱动向NK3\_ENTPD1细胞的分化**：MultiVelocity和扩散图谱分析显示从NK3\_GZMK向NK3\_CRTAM和NK3\_ENTPD1的双叉分化轨迹。从NK3\_GZMK向NK3\_ENTPD1的过渡中，早期表达CD44、GZMK，随后经历干扰素刺激基因（ISG）阶段，最终表达功能障碍和组织驻留基因。伪时间调控子分析显示从幼稚（TCF7、BACH2）向炎症（STAT1、NFKB）和AP-1家族调控子的转变。

* **CD39⁺ taNK细胞展现出增强的细胞毒性**：空间转录组学证实ENPTD1与ITGAE、ITGA1在taNK细胞中共定位。流式显示CD39⁺ taNK细胞表达更高水平的GZMA。经细胞因子或K562刺激后，CD39⁺ taNK细胞中GZMB、Ki67和CD107a显著升高。体外taNK模型分选实验表明，CD39⁺CD103⁺CD49a⁺ NK细胞对靶细胞的杀伤能力显著高于CD39^?亚群和双阴性NK细胞。

* **NKG2A阻断增强CD39⁺ taNK细胞的效应能力**：流式证实NKG2A主要在CD39⁺ taNK细胞上表达。PDTF平台中，抗NKG2A处理48小时后，CD39⁺ taNK细胞中GZMB⁺和GZMA⁺比例显著增加。体外杀伤实验显示，抗NKG2A处理显著增强CD39⁺和CD39^?CD103⁺CD49a⁺ NK细胞的杀伤能力，其中CD39⁺亚群表现出最强的效应提升。

**总结与讨论**：该研究揭示了NSCLC中taNK细胞的组织驻留、功能障碍与强细胞毒活性并存的特征，CD39⁺ taNK细胞是从GZMK⁺前体经炎症信号分化而来的主要效应群体，其抗肿瘤活性可被NKG2A阻断选择性增强。尽管taNK细胞表达多种抑制性受体，但并非终末耗竭状态，可经IL-15体外扩增并保持细胞毒功能。研究结论翻译如下：综上所述，研究人员提供了人肺癌NK细胞状态的整合转录和表观遗传图谱，并确定CD39⁺ taNK细胞为高度细胞毒的效应亚群。其抗肿瘤活性可通过NKG2A阻断选择性增强，建立了taNK细胞表型与治疗应答之间的功能联系。这些发现突显了CD39⁺ taNK细胞轴作为肺癌下一代NK细胞免疫治疗的有前景靶点。研究人员指出，未来需在体内环境下验证这些动态过程，并评估taNK细胞细胞毒性的持久性。