用于洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cenocepacia)体外与体内研究中可调蛋白表达的优化cumate toolkit

《Applied and Environmental Microbiology》：Optimized cumate toolkit for tunable protein expression during in vitro and in vivo studies of Burkholderia cenocepacia

　　

可诱导基因表达对剖析细菌生理与毒力机制至关重要。在伯克霍尔德菌属(Burkholderia spp.)中，目前可用的可诱导系统种类有限，难以实现严密调控。本研究构建了适用于洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cenocepacia)的一组cumate（4-异丙基苯甲酸）诱导载体，具备极低本底表达(basal expression)并能在该菌真核细胞内控制基因表达。研究人员通过对cumate回路及cumate调控因子(CymR)进行诱变研究，生成了优化的cumate回路（PCymRC/CymRGV），经荧光与蛋白O-连接(O-linked)糖基化分析评估，该回路可在B. cenocepacia中实现严密且可调的蛋白表达控制。利用比较蛋白质组学，研究人员发现cumate引发的B. cenocepacia蛋白质组改变较为局限，且与广泛使用的鼠李糖(rhamnose)诱导系统所产生的扰动相互正交(orthogonal)，支持cumate诱导作为伯克霍尔德菌属蛋白表达的互补策略。借助cumate的细胞渗透性及基于CTX的染色体整合载体，研究人员证明在B. cenocepacia胞内复制过程中也可实现蛋白表达的可诱导控制。通过控制胞内O-连接蛋白糖基化表达，研究人员证实蛋白糖基化有助于B. cenocepacia实现最优胞内复制。本工作表明cumate诱导系统即使在宿主-病原体(host-pathogen)背景下也能在伯克霍尔德菌属中实现精确可调的基因表达。

该研究发表于《应用与环境微生物学》（Applied and Environmental Microbiology）。研究背景方面，可诱导基因表达系统是解析细菌生理与毒力机制不可或缺的工具，理想系统应具备快速响应、高动态范围、低本底表达(basal expression)等特征。目前在伯克霍尔德菌属(Burkholderia spp.)中可用的诱导系统有限，已有的碳水化合物类诱导系统如P_BAD/AraC（阿拉伯糖诱导）和P_rha/RhaRS（鼠李糖诱导）存在明显缺陷：P_BAD本底表达偏高且需高浓度L-阿拉伯糖才能实现均一诱导；P_rha虽调控严密，但鼠李糖本身会引起伯克霍尔德菌较大蛋白质组扰动，且这类糖类诱导剂在宿主-病原体研究中对真核细胞可能有代谢干扰。洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cenocepacia)是洋葱伯克霍尔德菌复合体(Bcc)的重要机会性致病菌，常见于囊性纤维化(CF)患者肺部感染并可长期胞内 persistence，但其研究受限于固有多重耐药导致的筛选标记受限，以及缺乏精密可调、正交(orthogonal)、非代谢性的诱导系统。因此研究人员希望开发一套基于cumate（4-异丙基苯甲酸，细胞渗透、无毒、在缺乏cumate代谢途径的菌中非代谢性）的优化诱导载体 toolkit，用于B. cenocepacia体外与体内（包括胞内感染模型）的可调蛋白表达，并评估其对蛋白质组的扰动是否与现有系统正交，同时利用该工具研究蛋白O-连接糖基化在胞内复制中的作用。

关键技术方法方面，研究人员主要采用分子克隆与定点诱变构建不同cumate回路变体的pBBR1骨架质粒及Mini-CTX1染色体整合载体；使用sfGFP荧光蛋白和蛋白O-连接糖基转移酶PglL（BCAL0960）及其底物BCAL1086-his作为报告体系，通过免疫印迹(Western blot)、定量糖蛋白质组学(glycoproteomics)评估本底与诱导表达；采用数据非依赖采集(DIA)蛋白质组学比较cumate与鼠李糖诱导对B. cenocepacia全蛋白组的扰动；通过三亲接合将质粒导入B. cenocepacia，利用Mini-CTX1系统将诱导回路单拷贝整合至染色体attB位点并经FLP-flippase切除抗性标记；使用THP-1分化巨噬细胞模型，以庆大霉素保护实验(Gentamicin protection assay)评估胞内复制，辅以免疫荧光显微镜观察胞内诱导表达；所有定量数据以生物学重复进行分析。

研究结果如下。

The cumate circuit P_Cym/CymR is functional yet displays high basal expression in B. cenocepacia：研究人员将经典cumate回路P_Cym/CymR构建入pBBR1载体pCumate-sfGFP和pCumate-PglL_Bc-his，在B. cenocepacia K56-2及ΔpglL BCAL1086-his背景下测试。Western blot显示sfGFP呈cumate剂量依赖性表达；但以PglL驱动BCAL1086-his糖基化为更灵敏读数时发现，即使无诱导也出现糖基化信号，定量糖蛋白质组学在无诱导条件下检测到糖肽，证明P_Cym/CymR在B. cenocepacia中具有功能但本底表达较高，限制了用于酶促或敏感过程研究。

Combining CymR circuit features reduces basal expression：研究人员对比了此前文献报道的工程化回路P_CymRC/CymR_AM（含S110G、A171V突变，原为大肠杆菌优化），发现其在B. cenocepacia中本底sfGFP表达反而高于经典P_Cym/CymR。通过单与组合定点突变分析，确定A171V是导致本底升高的主要因素，S110G可部分抑制该效应；将CymR_AM的G110S、V171A回转为经典残基生成CymR_GV（G110S、V171A对应于AM变体的还原突变），并与启动子P_CymRC组合成P_CymRC/CymR_GV，在B. cenocepacia和大肠杆菌中均显示最低本底表达，且保留宽范围cumate剂量依赖性诱导（荧光与Western验证），解决了既往回路本底偏高与响应区间窄的问题。

P_CymRC/CymR_GVimproves tuneable control of protein expression in B. cenocepacia：将PglL置于P_CymRC/CymR_GV驱动构建pCumate_GV-PglL_Bc-his，转入ΔpglL BCAL1086-his后，无诱导时Western blot检测不到BCAL1086-his糖基化条带，定量糖蛋白质组与全蛋白质组也检测不到PglL及糖肽；cumate诱导后出现剂量依赖性BCAL1086-his糖基化与PglL表达，证明该优化回路可实现严密可调的蛋白表达控制。

Proteomic analysis of cumate and rhamnose induction within B. cenocepacia：研究人员以空载pBBR1-EV为对照，分别用cumate诱导pCumate_GV-MCS（无报告基因）和鼠李糖诱导常用pSCrhaB2载体，进行DIA蛋白质组学。cumate诱导仅引起21个蛋白丰度显著改变（主要涉及聚羟基丁酸酯合成酶PhbB BCAM2772、锌金属蛋白酶ZmpB BCAM2307下调，苯乙酸降解簇BCAL0212-BCAL0216上调等）；鼠李糖诱导引起27个蛋白改变（多个转录调控因子如LysR家族BCAM2332、GntR家族BCAL2744上调等）。PCA显示诱导样本与未诱导及空载明显分离，但cumate与鼠李糖诱导的蛋白质组扰动重叠极少（Upset图），说明cumate诱导的扰动局限且与鼠李糖系统正交。CymR_GV本身表达轻微改变宿主蛋白组，但cumate加入可逆转此效应接近空载状态；而鼠李糖诱导的扰动主要由RhaS/RhaR激活回路驱动，不同于cumate的解除阻遏机制。

Chromosomal P_CymRC/CymR_GVallows inducible control within an in vivo context revealing the requirement of protein O-linked glycosylation for optimal intracellular replication：研究人员将P_CymRC/CymR_GV装入Mini-CTX1整合载体，单拷贝插入B. cenocepacia K56-2 MH1K染色体attB位点，构建MH1K CTX::CymR_GV-sfGFP。在THP-1巨噬细胞感染模型（MOI=2，24 h）中，cumate存在时胞内可诱导sfGFP表达（Western及共聚焦免疫荧光验证），且细菌胞内负荷与无诱导及野生型无差异，证明染色体整合回路在感染背景下仍可实现诱导控制。进一步构建ΔamrABΔpglL CTX::CymR_GV-PglL_Bc-his菌株，证实cumate诱导恢复PglL表达与全细胞糖肽谱；胞内存活实验显示ΔpglL株负荷显著低于ΔamrAB亲本，cumate诱导PglL表达可将胞内CFU恢复至近亲本水平，表明O-连接蛋白糖基化有助于B. cenocepacia在THP-1巨噬细胞中实现最优胞内复制。

讨论部分总结：可诱导表达载体是分子微生物学关键工具，现有伯克霍尔德菌用碳水化合物诱导系统会影响中枢代谢并引发应激响应，而本研究评估并优化了cumate诱导系统在B. cenocepacia中的适用型。经典P_Cym/CymR虽有功能但本底偏高，工程化P_CymRC/CymR_AM在B. cenocepacia中本底更高且cumate响应区间更窄，其根源在于CymR_AM的S110G与A171V突变；通过将AM变体回转为G110S、V171A并与P_CymRC组合成P_CymRC/CymR_GV，实现了低本底与宽剂量可调性，在质粒与染色体整合形式中均严密可控。蛋白质组学表明cumate诱导仅引致有限且正交(orthogonal)于鼠李糖系统的扰动，其机制为cumate结合CymR_GV解除DNA结合（阻遏释放型），而鼠李糖系统为激活型(RhaS结合DNA驱动表达)，因此cumate对宿主基础蛋白组影响更小且加诱导后CymR_GV相关轻微扰动可被逆转。由于cumate细胞渗透，研究人员首次在胞内细菌感染模型（THP-1巨噬细胞）中实现染色体整合cumate系统的时空诱导控制，这套系统不局限于B. cenocepacia，也在Burkholderia thailandensis中验证有效；但需注意部分伯克霍尔德菌种（如Burkholderia xenovorans）具功能性cumate代谢cym途径，应用时需个案评估cumate非代谢性假设。利用该优化系统，研究人员证明O-连接蛋白糖基化（PglL_Bc）有助于B. cenocepacia在哺乳动物巨噬细胞模型中的最优胞内复制，此前仅在昆虫模型Galleria mellonella中报道过该表型。总体而言，本研究建立了优化cumate诱导载体toolkit，扩展了伯克霍尔德菌属遗传操作工具箱，可实现体外与体内（包括宿主-病原体背景）精密可调基因表达，并为研究胞内致病菌因子功能提供正交诱导手段。