艰难梭菌的相变菌落形态型在急性感染期间引发不同的宿主反应

《Infection and Immunity》：Phase variable colony morphotypes of Clostridioides difficile elicit distinct host responses during acute infection

　　

许多艰难梭菌（Clostridioides difficile）菌株可形成两种菌落形态型：粗糙型和光滑型。粗糙型和光滑型形态型在多种表型上存在差异，包括细胞长度和链状排列、运动性、生物膜产生以及仓鼠艰难梭菌感染（CDI）模型中的毒力。菌落形态经历相变，并由编码信号转导系统的cmrRST的ON/OFF表达决定。此处，研究人员检验了菌落形态和相关表型的差异影响发病机制和宿主对感染反应的假设。研究人员首先在小鼠CDI模型中比较了野生型艰难梭菌的粗糙型和光滑型菌落变体。然而，CmrRST相变在感染期间发生，使得艰难梭菌群体在粪便和组织中变得无法区分，并且接种这些变体的小鼠在疾病方面未观察到差异。研究人员接下来使用仅形成粗糙菌落或仅形成光滑菌落的突变体来规避相变。用这些表型锁定菌株对小鼠进行共感染揭示，光滑菌落突变体比粗糙突变体具有更大的适应性，后者在感染后期被竞争排除。此外，NanoString分析显示，感染粗糙菌落突变体的小鼠中，差异表达的促炎基因数量更多，且总体表达水平更高，这与细菌负荷和毒素水平无关。研究人员的结果表明，在小鼠CDI模型中，来自粗糙菌落的细胞在早期小鼠感染中更具免疫刺激性，可能导致与光滑菌落细胞相比相对适应性降低。

艰难梭菌（Clostridioides difficile）是一种革兰阳性产芽孢杆菌，是全球院内感染的主要原因之一。感染抗生素暴露破坏肠道菌群后，艰难梭菌可产生糖基化毒素TcdA和TcdB，引发从无症状携带到伪膜性结肠炎的一系列疾病。宿主免疫反应（如促炎细胞因子和趋化因子IL-1β、IL-6、CXCL1、CXCL2、TNF-α的升高）在疾病严重程度中起关键作用。许多艰难梭菌菌株（包括流行株R20291）能形成两种不同菌落形态型：粗糙型（具有卷须样结构）和光滑型（边缘圆润），二者通过cmrRST操纵子的相变可逆切换。该操纵子编码两个响应调控因子CmrR和CmrT以及一个组氨酸激酶CmrS，其表达由上游可逆DNA元件（cmr开关）的定向控制：ON方向驱动粗糙型，OFF方向产生光滑型。体外研究显示粗糙型细胞更长、易成链、表面运动性增强但泳动性减弱，且生物膜产量降低。在仓鼠急性CDI模型中，粗糙型分离株虽毒素积累相似却表现出更高毒力，但感染后期cmr开关偏向OFF状态。然而，仓鼠对毒素高度敏感，疾病过程快速致命，与多数人类CDI不符；小鼠模型更能复现人类病理，允许长期实验并评估宿主反应。因此，研究人员利用小鼠模型探究不同菌落形态型对宿主免疫应答的影响，并解决相变带来的混杂效应。这项研究发表在《Infection and Immunity》。

为开展研究，研究人员使用了C57BL/6小鼠（雌雄兼有，8-10周龄，购自查尔斯河实验室），通过抗生素预处理（卡那霉素、庆大霉素、黏菌素、万古霉素、甲硝唑混合饮水，随后克林霉素单次腹腔注射）使其易感艰难梭菌感染。主要技术包括：孢子纯化（蔗糖梯度法），定量PCR（qPCR）测定cmr开关在两个取向上的比例，竞争指数测定（利用壮观霉素抗性标记），组织学评估（H&E染色，由病理专家盲法评分），Vero细胞毒素中和法测定毒素水平，以及NanoString nCounter Mouse Host Response Panel进行转录组分析。所有统计检验均使用GraphPad Prism，差异显著性设为P<0.05。

**Comparison of wild-type rough and smooth colony variants in a murine model of CDI**
研究人员用野生型粗糙型（WT-R）和光滑型（WT-S）分离株的孢子接种小鼠，每日监测体重和粪便细菌负荷。两组小鼠均在感染后第1天开始体重减轻，高峰期在第2天，随后恢复；整个过程中体重变化和细菌负荷无显著差异。对第2天肠内容物进行毒素检测和结肠长度测量，发现粗糙型接种小鼠结肠显著缩短（提示炎症），而光滑型与对照组无差异，且两组毒素水平相当。此结果表明粗糙型变体可能在不依赖细菌负荷和毒素情况下引发更强的炎症反应。

**Wild-type rough and smooth colony variants undergo phase variation early during infection**
通过qPCR分析粪便和肠道组织中cmr开关的取向，发现粗糙型接种物（94.7% cmr-ON）在感染后第1天粪便中cmr-ON比例下降，第3天显著偏向cmr-OFF；光滑型接种物（4.0% cmr-ON）在第1天部分小鼠中cmr-ON增加，但同样在第3天转为cmr-OFF优势。在肠道组织（盲肠、近端结肠、远端结肠）中，粗糙型接种物第1天保持cmr-ON偏向，第2天转为OFF；光滑型接种物第1天远端结肠中cmr-ON显著增加，第2天几乎全部为OFF。这些结果表明，无论初始取向如何，感染早期cmr开关均发生动态相变，最终偏向cmr-OFF状态。

**Effect of CmrRST on the overall colonic inflammation during early infection**
为克服相变干扰，研究人员使用表型锁定突变体：cmrΔ3-ON（开关锁定为ON，仅产粗糙菌落）和ΔcmrRΔcmrT（缺失CmrR和CmrT，仅产光滑菌落），同时以野生型（WT，主要呈cmr-OFF）作为对照。接种后，所有感染组在第2天体重显著减轻，但组间无差异；细菌负荷、毒素积累均无显著差异。然而，WT和cmrΔ3-ON接种小鼠结肠长度显著短于对照，而ΔcmrRΔcmrT组无此变化；组织病理学评分（水肿、细胞浸润、上皮损伤）在各组间却无显著差异。这表明表型锁定粗糙突变体诱导了整体结肠炎症，但未体现在组织学严重程度上。

**The phase-locked smooth colony mutant outcompetes the locked rough mutant during infection**
采用1:1比例共接种cmrΔ3-ONR（标记壮观霉素抗性的粗糙锁定突变体）和ΔcmrRΔcmrT（光滑锁定突变体），通过选择性平板计算竞争指数（CI）。体外共培养显示两者在丰富培养基中适应性相当。在体内，感染后第1-4天CI接近1（同等适应性），但从第5天起CI显著降低，ΔcmrRΔcmrT完全竞争过cmrΔ3-ONR；到第6天，cmrΔ3-ONR几乎被清除，而ΔcmrRΔcmrT维持稳定高水平。该结果与野生型粪便中cmr-OFF占优的趋势一致，表明光滑型（cmr-OFF）在后期感染中更具适应性。

**Phenotypically locked smooth C. difficile elicits lower expression of Il1β, Cxcl1, Lcn2, and Tnfα in mice**
通过qRT-PCR检测感染第2天盲肠组织中促炎基因的表达。与模拟接种对照组相比，WT和cmrΔ3-ON组Il1β、Cxcl1、Lcn2、Tnfα的Log₂倍数变化均显著升高，而ΔcmrRΔcmrT组仅呈非显著变化。例如，Il1β在WT和cmrΔ3-ON组分别升高3.02和3.34（Log₂），而ΔcmrRΔcmrT组仅1.26；Cxcl1在WT和cmrΔ3-ON组分别升高4.58和5.27，ΔcmrRΔcmrT组仅1.41。这表明粗糙型菌落细胞（cmr-ON）能更强烈地诱导宿主促炎反应。

**Transcriptional response against phenotypically locked rough and smooth mutants**
利用NanoString Mouse Host Response Panel对感染第2天盲肠组织进行广谱转录分析。与模拟接种相比，WT感染导致56个差异表达基因（DE genes，13个下调，43个上调）；cmrΔ3-ON组共有100个DE基因（24个下调，76个上调），数量几乎是WT的两倍；ΔcmrRΔcmrT组有47个DE基因（17个下调，30个上调）。所有感染组共享31个DE基因，其中22个上调，9个下调；在共享基因中，cmrΔ3-ON组的倍数变化始终最高，包括Lrg1、Lcn2和Il33等强促炎因子。WT与cmrΔ3-ON另共享22个DE基因（包括Il1β和Cxcl1）。cmrΔ3-ON组还有27个独特上调基因，涉及IL-17信号通路（Casp3、Il13ra1、Ccl7等）。基因集富集分析（GSEA）显示，10个通路在所有感染组中富集，但cmrΔ3-ON组的归一化富集分数（NES）大多更高，包括炎症反应和KRAS信号通路等。这些结果一致表明粗糙型（cmr-ON）诱导了更强、更独特的免疫转录程序。

**讨论与结论**
该研究通过小鼠模型揭示了艰难梭菌粗糙型和光滑型菌落形态型在宿主免疫反应和适应性上的显著差异。初始使用野生型变体时，相变迅速发生使群体趋于cmr-OFF状态，掩盖了表型影响；为此研究人员采用表型锁定突变体，发现光滑型（ΔcmrRΔcmrT）在感染后期具有更强的竞争适应性，而粗糙型（cmrΔ3-ON）则被排除。这种适应性差异很可能源于宿主免疫驱动：粗糙型细胞诱导更高水平的促炎细胞因子（如Il1β、Cxcl1、Lcn2、Tnfα）和更广泛的转录重编程（NanoString显示100个DE基因及更强富集信号），而光滑型引发的免疫反应较弱，有利于其持续定殖。尽管组织病理学无显著差异，但转录水平的强烈免疫刺激可能通过中性粒细胞浸润、炎症损伤等方式对粗糙型细胞产生选择压力。此外，相变动态中cmr-ON细胞在第1天组织中的短暂优势提示该状态可能在早期肠道附着中有特殊作用，但长期代价更大。论文结论部分指出：在小鼠CDI模型中，来自粗糙菌落的细胞在早期感染中更具免疫刺激性，可能导致其相对适应性低于光滑菌落细胞。这一发现强调了菌落形态相变作为肠道感染中免疫逃避和适应性调控的重要机制，并为理解艰难梭菌的致病策略及宿主-病原相互作用提供了新视角。