胆固醇转运蛋白 Niemann-Pick C1（NPC1）促进猪流行性腹泻冠状病毒（Porcine epidemic diarrhea coronavirus，PEDV）的进入

《Journal of Virology》：The cholesterol transporter Niemann-Pick C1 facilitates the entry of porcine epidemic diarrhea coronavirus

　　

摘要：猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）是属于α冠状病毒属（Alphacoronavirus）的病毒，给养猪业造成重大经济损失，现有疫苗效力有限使其仍对全球生猪生产构成重大威胁。靶向细胞通路的宿主导向抗病毒策略是抵抗不断进化的病毒毒株的有前景的方法。基于前期研究发现胆固醇转运与PEDV进入高度相关，研究人员筛选了一系列胆固醇调节化合物对PEDV的抑制活性，鉴定出Niemann-Pick C1（NPC1）胆固醇转运蛋白的抑制剂U18666A是能广谱抑制多种PEDV基因型的强效抑制剂，在细胞系及猪肠道类器官中均有效。为验证NPC1为相关药理靶点，研究人员利用CRISPR/Cas9敲除Huh7细胞中NPC1，显著抑制了PEDV感染；反之在敲除细胞中强制表达NPC1可部分恢复病毒感染性。利用活PEDV及PEDV假病毒，研究人员证实NPC1促进PEDV的内化（internalization）进入。此外，免疫共沉淀（co-immunoprecipitation，Co-IP）和结构建模显示NPC1与PEDV棘突（spike，S）蛋白的膜融合亚基S2直接相互作用，NPC2亦参与此过程，表明NPC1/NPC2胆固醇转运复合体直接参与病毒进入。外源性胆固醇补充可部分抵消U18666A的抑制作用，强调高效PEDV进入需要功能性细胞内胆固醇转运而非仅依赖胆固醇存在。综上，本研究阐明PEDV劫持宿主NPC1/NPC2胆固醇转运机制以促进内吞进入的分子机制，鉴定该通路为开发广谱宿主导向抗病毒药物的潜在靶点。

论文解读：Niemann-Pick C1（NPC1）介导猪流行性腹泻病毒（PEDV）进入宿主细胞的机制研究

一、研究背景与立项依据

猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）为冠状病毒科α冠状病毒属（Alphacoronavirus），可致各年龄段猪急性水样腹泻与呕吐，新生仔猪死亡率近100%，对全球养猪业造成持续重大经济损失。尽管已有商品化疫苗，但对新发异源毒株（包括S基因插入缺失变体，S-INDEL）保护不完全，亟需靶向病毒感染必需宿主因子的新型抗病毒策略，此类靶点通常具有更高的耐药遗传屏障。前期转录组学分析提示细胞胆固醇稳态与PEDV进入密切相关，且胆固醇富集脂筏（lipid rafts）参与冠状病毒附着、进入及复制复合体形成，PEDV经网格蛋白介导的内吞作用（clathrin-mediated endocytosis）进入细胞并经内体—溶酶体途径转运，低pH触发S蛋白构象变化介导膜融合，但具体进入机制尚未完全阐明。Niemann-Pick C1（NPC1）是位于晚期内体/溶酶体（late endosomes/lysosomes，LE/Ly）膜上的多跨膜蛋白，与可溶性NPC2协同将未酯化胆固醇从LE/Ly向外转运，亦是埃博拉病毒（Ebola virus）进入必需的胞内受体，部分冠状病毒亦可能涉及NPC1，但NPC1对PEDV感染的作用尚未明确。该研究据此探究胆固醇调节化合物及NPC1/NPC2在PEDV感染中的功能与分子机制，论文发表于《Journal of Virology》。

二、主要关键技术方法概述

研究人员以Vero细胞、Huh7细胞、HEK293T细胞及原代培养的猪小肠类器官（二维与三维）为模型，使用G1型（SD株，含重组rPEDV-SD-EGFP）与G2型（HM株，含重组rPEDV-HM-EGFP）PEDV及携带PEDV S蛋白的重组水泡性口炎病毒假病毒（rVSV-ΔG-EGFP-PEDV-S）。主要技术方法包括：胆固醇相关小分子化合物筛选结合CC₅₀细胞毒性检测与流式细胞术、TCID₅₀病毒滴定；利用CRISPR/Cas9慢病毒系统构建NPC1与NPC2敲除（knockout，KO）单克隆细胞系并经Western blot与测序验证；NPC1回补（forced expression）实验；病毒附着（on ice）与内化（37℃后蛋白酶去除未内化病毒）实验结合RT-qPCR定量病毒RNA；免疫共沉淀（co-immunoprecipitation，Co-IP）及Strep-tag Pull-down验证蛋白互作；AlphaFold结构预测与分子对接分析NPC1–PEDV S及NPC1–NPC2–PEDV S三元复合体；外源水溶性胆固醇挽救实验评估U18666A抑制的可逆性。

三、研究结果

筛选与鉴定胆固醇相关小分子化合物为PEDV潜在抑制剂（Screening small-molecule compounds related to cholesterol as potential inhibitors of PEDV infection）

研究人员用10种胆固醇转运/代谢调节剂预处理Vero与Huh7细胞后感染rPEDV-SD-EGFP，经流式细胞术、荧光显微镜与TCID₅₀检测，筛选出U18666A、Evacetrapib、Dalcetrapib和Fenofibrate具显著剂量依赖性抑病毒作用，其中U18666A抑制最强且在非细胞毒性浓度下对不同细胞系有效，选定其用于后续研究。

U18666A抑制不同基因型PEDV（U18666A inhibits different genotypes of PEDV）

U18666A预处理并以药物维持培养，可剂量依赖性地降低G1型SD株与G2型HM株PEDV的EGFP阳性细胞比例、S和N蛋白表达量及上清病毒滴度，表明U18666A对多基因型PEDV具广谱抑制活性。

U18666A抑制猪肠道类器官中PEDV感染（U18666A inhibits PEDV infection in porcine intestinal organoids）

在二维（2D）与三维（3D）猪小肠类器官模型中，1 μg/mL U18666A预处理并维持培养显著降低rPEDV-HM-EGFP感染率与上清病毒滴度，且无显著细胞毒性，提示U18666A在更接近体内生理模型中具抗PEDV潜力。

U18666A作用于PEDV感染多阶段（U18666A effects on different infection steps of PEDV）

分别进行感染前预处理、共处理、感染后处理及全程处理，U18666A均显著抑制感染，全程处理抑制最强；病毒生长动力学显示U18666A剂量依赖性地阻碍PEDV复制，表明其靶向病毒生活周期多个环节。

NPC1是PEDV感染的关键宿主因子（NPC1 is a critical factor for PEDV infection）

CRISPR/Cas9构建NPC1-KO Huh7细胞，Western blot确认NPC1蛋白缺失。NPC1-KO细胞中活PEDV及rVSV-ΔG-EGFP-PEDV-S假病毒感染率与病毒滴度显著低于野生型（wild-type，WT），病毒生长曲线显示早期复制延迟，证明NPC1是PEDV感染发挥功能所必需的宿主因子。

NPC1影响PEDV内化（NPC1 affects the internalization of PEDV）

PEDV假病毒在NPC1-KO细胞中进入效率显著下降，而对照VSV假病毒无差异。真实病毒附着实验（冰上结合）显示NPC1-KO细胞表面结合病毒RNA反而高于WT，内化实验（37℃ 1 h后去除未内化病毒）则显示NPC1-KO细胞内化病毒RNA显著减少，表明NPC1特异地促进PEDV内化/进入步骤而非初始附着。

NPC1强制表达部分恢复NPC1-KO细胞中PEDV感染性（Forced expression of NPC1 partially restores PEDV infectivity in NPC1-KO cells）

在NPC1-KO细胞中重新导入NPC1表达载体，NPC1蛋白成功表达且高于WT内源水平，rPEDV-SD-EGFP感染率较空载体转染的KO细胞部分回升；而WT Huh7细胞过表达NPC1不改变感染水平，提示内源性NPC1已足以支持PEDV进入，NPC1为必要但非限速因子，KO细胞回补未完全恢复可能与长期缺失引发的适应性改变有关。

外源胆固醇减弱U18666A对PEDV进入的抑制（Exogenous cholesterol diminishes the inhibitory effect of U18666A on PEDV entry）

Vero细胞予水溶性胆固醇预孵育后加U18666A再感染PEDV假病毒，外源胆固醇可部分提升U18666A处理后的EGFP阳性细胞比例，但未达未处理对照组水平，说明功能性胞内胆固醇转运（NPC1介导）而非单纯膜胆固醇含量是PEDV高效进入所需。

NPC1与PEDV S蛋白尤其是S2亚基相互作用（NPC1 interacts with PEDV S protein, specifically the S2 subunit, but not the S1 subunit）

AlphaFold建模与Prodigy结合能预测及Co-IP/Strep-tag Pull-down均证实NPC1与全长PEDV S蛋白结合；分段实验显示NPC1特异性结合S2（膜融合亚基）而不结合S1（受体结合亚基）；NPC1的A结构域（1–270 aa）、C结构域（380–625 aa）和I结构域（854–1098 aa）均可结合S蛋白，其中A与I结构域结合较强，C结构域较弱。

NPC2协同NPC1促进PEDV感染（NPC2 cooperates with NPC1 to facilitate PEDV infection）

Co-IP证实NPC1与NPC2相互作用；CRISPR/Cas9构建NPC2-KO Huh7细胞后PEDV感染率与病毒滴度显著下降；Co-IP显示NPC2亦与PEDV S蛋白结合；分子对接预测NPC1–NPC2–PEDV S三元复合体，NPC1作为中心支架分别与NPC2及PEDV S结合，表明PEDV利用完整NPC1/NPC2胆固醇转运复合体协助进入。

四、讨论与结论总结（翻译浓缩）

PEDV持续威胁全球养猪业，现用疫苗无法完全防护，靶向宿主因子的新策略至关重要。本研究基于前期胆固醇稳态与PEDV进入相关性，筛选发现NPC1抑制剂U18666A对多基因型PEDV具广谱抑制活性，并在猪肠道类器官中验证。研究证明NPC1是PEDV进入所必需的宿主因子，NPC1通过其A、C、I结构域直接与PEDV S蛋白S2亚基相互作用（不结合S1），NPC2与NPC1协同形成三元复合体参与病毒内化；NPC1缺失不影响病毒初始附着但显著削弱内化，外源胆固醇仅部分挽救U18666A抑制效果，说明功能性NPC1介导的胆固醇转运是PEDV高效进入的关键。与埃博拉病毒（NPC1作为胞内受体触发内体逃逸）及SARS-CoV-2（可能部分不依赖胆固醇转运功能）不同，PEDV劫持完整NPC1/NPC2胆固醇转运 machinery并于晚期内体/溶酶体通过S2–NPC1互作促进膜融合与基因组释放。研究局限包括在人与猴细胞系中获得机制并在猪源类器官初探，人猪NPC1高度同源（全长～89.5%一致，关键结构域及互作残基保守），但仍需在原代猪肠上皮细胞确认；体内靶向NPC1存在潜在毒性风险，未来应探索肠道上皮局部递送策略。综上所述，研究人员鉴定U18666A为强效广谱PEDV进入抑制剂，明确NPC1/NPC2是PEDV感染的关键宿主决定因子，PEDV通过S2亚基直接结合NPC1并利用NPC1/NPC2胆固醇转运复合体促进病毒内化与膜融合，该宿主—病毒互作界面为开发广谱宿主导向抗病毒药物提供了新靶点。