《Journal of Virology》：African swine fever virus pM448R protein promotes STUB1-mediated ubiquitin-proteasome degradation of IRF1 to attenuate type III interferon induction
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非洲猪流感病毒（ASFV）主要经呼吸道和肠道黏膜入侵，Ⅲ型干扰素（IFN-λ）在局部免疫中发挥关键作用。然而，ASFV是否拮抗IFN-λ介导的抗病毒防御尚不清楚。本研究表明，ASFV感染可抑制IFN-λ产生，其中病毒蛋白pM448R发挥抑制作用。机制上，pM4
非洲猪流感病毒（ASFV）主要经呼吸道和肠道黏膜入侵，Ⅲ型干扰素（IFN-λ）在局部免疫中发挥关键作用。然而，ASFV是否拮抗IFN-λ介导的抗病毒防御尚不清楚。本研究表明，ASFV感染可抑制IFN-λ产生，其中病毒蛋白pM448R发挥抑制作用。机制上，pM448R通过招募E3泛素连接酶STUB1（STIP1同源性与U盒结构域蛋白1），催化IRF1（干扰素调节因子1）的K48连接泛素化，从而靶向IRF1进行蛋白酶体降解。此外，感染M448R缺失的ASFV突变体可导致IRF1蛋白稳定性增加及其靶基因（包括OAS1、OAS2和ZBP1）表达上调。研究揭示了ASFV劫持宿主泛素-蛋白酶体系统降解IRF1的新型免疫逃逸策略，从而破坏IRF1依赖性转录程序（包括IFN-λ诱导），促进黏膜入侵。
非洲猪病毒（ASFV）对全球养猪业构成重大威胁，但病毒如何在入侵门户逃逸黏膜先天免疫仍知之甚少。Ⅲ型干扰素（IFN-λ）在黏膜抗病毒防御中发挥不可替代的作用，其受体主要分布于黏膜上皮细胞，可在病毒入侵"门户"建立局部强效抗病毒效应。转录因子IRF1是IFN-λ诱导的核心调控因子，广泛协调黏膜屏障处多种抗病毒限制因子的表达。已有研究表明，预防性给予猪源IFN-λ3、IFN-α2和IFN-γ融合蛋白可显著诱导多种ISG表达、降低病毒载量并延缓死亡，提示黏膜免疫在ASFV感染初期具有关键作用。然而，目前关于ASFV与黏膜免疫相互作用的认识极为有限，尤其缺乏ASFV特异性拮抗IFN-λ诱导和信号转导机制的研究。
研究人员在《Journal of Virology》发表的研究中，首次系统阐明了ASFV蛋白pM448R靶向降解IRF1以抑制IFN-λ产生的分子机制。研究采用的主要技术方法包括：以原代猪肺泡巨噬细胞（PAMs）和猪肠上皮细胞系IPEC-J2为模型细胞；利用双荧光素酶报告基因系统筛选160种ASFV编码蛋白对IFN-λ1启动子活性的调控作用；通过同源重组技术构建ASFV M448R基因缺失突变体（ASFV-ΔM448R）；运用蛋白质免疫共沉淀（Co-IP）结合激光共聚焦显微镜分析蛋白相互作用与亚细胞定位；采用泛素化突变体质粒（K48-only、K63-only等）鉴定IRF1的具体泛素化类型；借助siRNA干扰技术验证STUB1在IRF1降解中的功能必需性。
**ASFV感染抑制原代猪肺泡巨噬细胞中Ⅲ型干扰素的产生**
研究人员首先检测了ASFV感染后PAMs中IFN-λ基因的转录动力学。结果显示，ASFV感染在早期可诱导低水平的IFN-λ1、IFN-λ3和IFN-λ4基因转录，但poly(I:C)诱导的IFN-λ1、IFN-λ3和IFN-λ4 mRNA水平在ASFV感染后被显著抑制，表明ASFV能够抑制PAMs中IFN-λ的产生。
**ASFV pM448R抑制Ⅲ型干扰素的产生**
为鉴定介导IFN-λ抑制的病毒蛋白，研究人员对160种ASFV编码蛋白进行了双荧光素酶报告基因筛选，发现8种蛋白（pI267L、pEP364R、pE120R、pH240R、pM448R、pA137R、pK205R和pMGF505-7R）可显著抑制IFN-λ1启动子活性，其中pM448R的抑制效应最强。剂量依赖性实验证实，pM448R以剂量依赖方式抑制IFN-λ1和IFN-λ3启动子活性，并显著抑制poly(I:C)诱导的内源性IFN-λ1和IFN-λ3转录，表明pM448R是IFN-λ产生的强效抑制剂。
**pM448R通过靶向IRF1抑制Ⅲ型干扰素产生**
鉴于IFN-λ产生受IRF3、NF-κB和IRF1等多种转录因子协同调控，研究人员进一步鉴定pM448R的特异性靶点。结果显示，pM448R不影响poly(I:C)或仙台病毒（SeV）刺激诱导的IRF3磷酸化以及NF-κB激活。双荧光素酶报告基因检测发现，pM448R特异性抑制IRF1启动子驱动的荧光素酶报告基因活性，而不影响IRF3和NF-κB的转录活性。在IRF1过表达条件下，pM448R显著抑制IRF1介导的IFN-λ1和IFN-λ3启动子活性，提示pM448R通过靶向IRF1抑制IFN-λ产生。
**pM448R促进IRF1的蛋白酶体降解**
研究人员观察到ASFV感染早期可上调IRF1表达，但随着感染进展，IRF1蛋白水平逐渐下降，且随MOI增加而降低。pMA48R可抑制poly(I:C)或TNF-α诱导的IRF1蛋白上调，但不影响IRF1 mRNA水平。蛋白酶体抑制剂MG132可显著挽救pM448R介导的IRF1降解，而溶酶体抑制剂氯喹（CQ）和NH?Cl无此效果，表明pM448R通过泛素-蛋白酶体途径促进IRF1降解。
**pM448R与IRF1相互作用并诱导其K48连接泛素化**
Co-IP实验证实pM448R与IRF1存在相互作用，激光共聚焦显微镜观察到两者在细胞质中共定位。Co-IP分析显示pM448R增加IRF1的泛素化水平。通过使用泛素赖氨酸保留突变体（K63-only、K48-only、K11-only）和赖氨酸-精氨酸突变体（K63R、K48R、K11R）进行实验，研究人员发现pM448R特异性促进IRF1的K48连接多聚泛素化。
**pM448R促进STUB1介导的IRF1泛素化及后续降解**
研究人员筛选了TRAF3、TRIM28、STUB1、CBL、TRAF6和SPOP等多种E3泛素连接酶对IRF1泛素化的调控作用，发现pM448R与STUB1存在相互作用，激光共聚焦显微镜证实两者在细胞质中共定位。剂量依赖性实验显示pM448R增强STUB1与IRF1的相互作用，Co-IP分析证实pM448R促进STUB1介导的IRF1泛素化。STUB1特异性siRNA干扰抑制了pM448R诱导的IRF1降解，而外源重组STUB1可恢复该效应。在ASFV感染的PAMs中，STUB1敲低同样抑制IRF1降解，表明pM448R通过招募STUB1介导IRF1泛素化及后续降解。
**ASFV-ΔM448R促进IRF1靶基因的表达**
研究人员通过同源重组构建了ASFV-ΔM448R突变体，经PCR鉴定和多次纯化后获得纯重组病毒，全基因组测序确认未引入额外表型改变突变。生长曲线分析显示ASFV-ΔM448R与亲本病毒在PAMs中的复制无显著差异。Western blot分析显示，ASFV-ΔM448R感染PAMs中IRF1蛋白丰度显著高于野生型病毒感染细胞。qPCR分析显示，ASFV-ΔM448R感染导致IRF1靶基因OAS1、OAS2和ZBP1的mRNA水平升高，IFN-λ1和IFN-λ3转录亦呈类似趋势，表明pM448R通过降低IRF1蛋白稳定性抑制IRF1依赖性抗病毒基因表达。
在讨论部分，研究人员指出IFN-λ自2003年发现以来已被确认为黏膜免疫的关键调节因子，ASFV感染早期诱导低水平IFN-λ转录、后期显著抑制的动态模式提示病毒主动调控。pM448R作为此前未表征的ASFV蛋白，通过靶向IRF1抑制IFN-λ产生，但M448R缺失未损伤病毒在PAMs中的复制，这可能因为巨噬细胞并非IFN-λ的主要来源且不表达高水平受体。值得注意的是，pM448R与T4 RNA连接酶1（Rnl1）家族成员及ATP依赖性核苷酸转移酶超家族（包括RNA加帽酶）具有结构同源性，提示其可能兼具RNA连接酶或加帽活性，可干扰免疫刺激性RNA的积累或识别。ASFV编码多种靶向干扰素途径的蛋白，功能冗余可能补偿M448R的缺失。
研究结论：该研究鉴定ASFV蛋白pM448R为通过招募E3连接酶STUB1靶向转录因子IRF1进行泛素-蛋白酶体降解的病毒拮抗因子。pM448R通过促进IRF1降解，抑制IRF1依赖性抗病毒基因（包括编码Ⅲ型干扰素的基因）的表达。该工作首次证实ASFV主动破坏IRF1介导的转录程序，为理解病毒逃逸黏膜先天免疫防御的策略提供了新见解。
