IFITM1和IFITM3协同限制病毒进入内吞溶酶体

《Journal of Virology》：IFITM1 and IFITM3 cooperate to restrict virus entry in endolysosomes

　　

干扰素诱导的跨膜（IFITM）蛋白在细胞进入阶段限制病毒感染。研究人员先前鉴定了人IFITM3的CD225结构域中的一个GxxxG基序，该基序介导其多聚化，这对于IFITM3降低膜流动性及其抗甲型流感病毒的活性至关重要。本研究采用免疫沉淀结合质谱的无偏方法，研究人员证明GxxxG基序对于IFITM3与其它蛋白（包括IFITM1）的相互作用也很重要。IFITM1主要被视为一种细胞表面蛋白，限制在质膜融合的病毒进入，但该模型主要基于过表达研究，且有悖于一些显示其可限制内吞病毒的研究。本研究中，研究人员证明内源性IFITM1和IFITM3共同定位于酸性晚期内体溶酶体（endolysosomes）膜，并通过免疫共沉淀和邻近连接实验（proximity ligation assay, PLA）确定其相互作用。敲低内源性IFITM3导致IFITM1在质膜的定位增强，表明IFITM3促进IFITM1向内吞溶酶体的定位。为评估内源性IFITM1和IFITM3对内吞溶酶体膜融合病毒的抗病毒保护作用，研究人员测量了甲型流感病毒对细胞的感染。单独敲低IFITM1或IFITM3显著增加感染，而联合敲低两者则使感染大幅提升。这些结果表明，内源性IFITM1和IFITM3以内吞溶酶体中的协同方式限制甲型流感病毒的进入。

# 论文解读：IFITM1与IFITM3协同限制病毒进入内吞溶酶体

## 研究背景与目的
干扰素诱导的跨膜（IFITM）蛋白是细胞固有免疫的关键效应分子，在病毒进入细胞阶段发挥限制作用。人类基因组编码三个主要成员：IFITM1、IFITM2和IFITM3，它们通过基因复制事件进化而来。此前研究表明，IFITM3的CD225结构域中的GxxxG基序介导其同源多聚化，该多聚化对IFITM3降低膜流动性及抗甲型流感病毒（Influenza A virus）活性至关重要。然而，IFITM1的定位与功能存在争议：多数研究基于过表达模型认为IFITM1主要定位于细胞表面，限制在质膜融合的病毒（如呼吸道合胞病毒、HIV-1）进入；但部分研究提示IFITM1可抑制内吞病毒（如甲型流感病毒、埃博拉病毒），暗示其可能存在于胞内膜系统。此外，内源性IFITM蛋白之间是否存在相互作用，以及这种相互作用是否调控其抗病毒功能，尚不明确。由于GxxxG基序在IFITM1和IFITM2中高度保守，研究人员推测该基序不仅介导同源多聚化，还可能介导IFITM家族成员间的异源相互作用。因此，本研究旨在探究内源性IFITM1与IFITM3的相互作用及其亚细胞定位，并评估两者在限制甲型流感病毒进入中的协同作用。该研究发表在《Journal of Virology》。

## 关键技术方法
1. **免疫共沉淀结合质谱（co-immunoprecipitation coupled with mass spectrometry, co-IP-MS）**：在稳定表达FLAG标签的IFITM3野生型（WT）或G95L突变体的HEK293T细胞中，用抗FLAG抗体免疫沉淀，通过串联质谱鉴定差异互作蛋白。
2. **邻近连接实验（proximity ligation assay, PLA）**：使用抗IFITM1和抗IFITM3抗体，检测细胞内源性或外源蛋白在<30 nm距离内相互作用，结合共聚焦显微镜观察。
3. **共聚焦免疫荧光显微镜**：使用LysoTracker标记酸性晚期内体溶酶体，共定位分析内源性IFITM1和IFITM3的亚细胞分布；通过RNA干扰（siRNA）敲低特定IFITM蛋白后观察定位变化。
4. **RNA干扰与病毒感染实验**：在HeLa细胞中转染靶向IFITM1或IFITM3的siRNA，72小时后以0.1 MOI的甲型流感病毒A/PR/8/34（H1N1）接种，18小时后通过抗NP蛋白抗体染色和流式细胞术检测感染率。
样本来源包括人胚肾HEK293T细胞（ATCC）、宫颈癌HeLa细胞（ATCC）和人原代鼻上皮细胞（Epithelix公司）。

## 研究结果
### IFITM3与IFITM1以G95依赖性方式相互作用
通过免疫共沉淀质谱分析，研究人员发现内源性IFITM1优先与FLAG-IFITM3 WT共沉淀（丰度比约为9倍），而与FLAG-IFITM3 G95L突变体结合显著减弱。免疫共沉淀验证了该结果：内源性IFITM1与IFITM3 WT共沉淀量高于G95L。PLA实验显示，在共转染IFITM1和IFITM3 WT的HEK293T细胞中，PLA荧光主要分布于胞内区室和质膜附近，而转染IFITM1与IFITM3 G95L的细胞中荧光显著减少，表明G95（GxxxG基序关键残基）对两者相互作用至关重要。

### 内源性IFITM1与IFITM3在多种细胞类型中相互作用
在HEK293T细胞中，IFN-β处理后两者表达上调，免疫共沉淀证实IFITM3可拉下IFITM1。PLA在细胞质中检测到广泛的相互作用信号。在HeLa细胞中，基础水平和IFN-β诱导后两者持续相互作用，且该信号在IFITM3敲除细胞中消失。此外，内源性IFITM2也可与IFITM1和IFITM3共沉淀。

### 内源性IFITM1和IFITM3共定位于内吞溶酶体，且IFITM3控制IFITM1的定位
共聚焦显微镜显示，HeLa细胞中内源性IFITM1和IFITM3部分共定位于LysoTracker阳性的酸性晚期内体溶酶体（endolysosomes）中。敲低IFITM3后，IFITM1在细胞外围的荧光强度显著增加，且与LysoTracker的共定位减少。补偿实验表明，回补IFITM3 WT可恢复IFITM1在内吞溶酶体中的定位，而回补IFITM3 Y20A（破坏AP-2介导的内吞分选信号YxxL）突变体则导致IFITM1主要滞留于细胞表面，说明IFITM3通过其内吞分选信号促进IFITM1向内吞溶酶体的运输。

### 内源性IFITM1和IFITM3协同限制甲型流感病毒感染
在HeLa细胞中，单独敲低IFITM1（使用siRNA IFITM1B）使甲型流感病毒感染率提高4.5倍，单独敲低IFITM3提高7.5倍。联合敲低两者则使感染率大幅升高35倍，显著高于单独敲低的效果。该结果表明内源性IFITM1和IFITM3在限制病毒进入内吞溶酶体过程中发挥协同作用，且IFITM1的抗病毒活性依赖于IFITM3对其定位的调控。

## 讨论与结论
讨论部分指出，内源性IFITM1与IFITM3的相互作用对后者功能至关重要。敲低IFITM3导致IFITM1错误定位至质膜，提示过往依赖单个IFITM基因敲低或过表达的研究结论需重新审视——IFITM3敲低后的感染表型可能部分源于IFITM1定位改变。该发现解释了为何联合敲除IFITM1、IFITM2和IFITM3的效果与仅敲除IFITM2/3无显著差异（可能因IFITM1在IFITM2/3缺失细胞中已失位）。IFITM3通过其YxxL内吞基序牵引IFITM1进入内吞溶酶体，而IFITM1本身也存在AP-3依赖的分选信号，IFITM3可能稳定该信号以增强识别。此外，IFITM3近期被报道通过SNARE样基序调控内体-溶酶体融合，IFITM1可能在该过程中协同作用。研究结论（结合IMPORTANCE部分）总结：人类基因组编码多种IFITM蛋白，其基因座在多个物种中通过复制扩展，但原因未知。本研究表明，两种已知抗病毒的人IFITM蛋白——IFITM1和IFITM3，在内吞溶酶体中相互相互作用。RNA干扰实验发现，单独敲低IFITM1或IFITM3增加甲型流感病毒感染易感性，而联合敲低进一步加剧感染，证明两者均作为病毒进入内吞溶酶体的屏障。此外，IFITM3对IFITM1运输至内吞溶酶体是必需的。总体而言，研究揭示通过基因复制相关的IFITM蛋白进化出协同工作以限制病毒感染；由于人类以外的许多物种中存在独特的IFITM基因复制，可能还有多种IFITM蛋白间的协同与调控机制有待发现。