毒力质粒对趋同型碳青霉烯耐药与高毒力肺炎克雷伯菌表型及转录组的差异性与共有性影响

《Microbiology Spectrum》：Distinct and shared impacts of virulence plasmids on the phenotype and transcriptome in convergent carbapenem-resistant and hypervirulent Klebsiella pneumoniae

　　

全球范围内，趋同型碳青霉烯耐药与高毒力肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistant and hypervirulent Klebsiella pneumoniae，CR-hvKp）的上升已构成重大临床挑战，然而毒力质粒（virulence plasmids，pVirs）在塑造细菌生理特性与致病性中的作用仍未得到充分阐明。研究人员采用基于CRISPR-Cas9的质粒清除系统，从两株具有不同遗传背景的临床CR-hvKp菌株——序列型23（sequence type 23，ST23）-KL1（bla_NDM-1）和ST11-KL64（bla_KPC-2）——中精确去除了pVir。pVir缺失使菌株在体外获得适应度优势，降低了荚膜生成和高黏液性（hypermucoviscosity，HMV），并促进生物被膜形成，同时在小鼠脓毒症模型中显著减弱毒力。尽管毒力下降，去除pVir后的ST23-KL1菌株仍表现出高于去除pVir后的ST11-KL64菌株的毒力，提示染色体背景对致病潜能具有重要贡献。转录组分析显示，pVir删除可诱导共有及菌株特异性的转录应答，其中ST11-KL64菌株出现更广泛的转录扰动。pVir去除对抗菌药物最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentrations，MICs）的影响有限。回复实验进一步表明，rmpADC与rmpA2D2操纵子在两株菌中对荚膜表达和HMV的调控作用存在差异。综上，这些结果确立了pVir是CR-hvKp毒力的核心决定因素，并凸显了影响细菌适应与致病性的复杂宿主-质粒相互作用。

该论文发表于《Microbiology Spectrum》，聚焦于趋同型碳青霉烯耐药与高毒力肺炎克雷伯菌（CR-hvKp）中毒力质粒（pVir）的功能解析。研究背景在于，肺炎克雷伯菌的高毒力与多重耐药性原本多分属不同进化路径：经典肺炎克雷伯菌（cKp）多与医院获得性感染和多重耐药相关，而高毒力肺炎克雷伯菌（hvKp）则以侵袭性强、可导致肝脓肿、菌血症、肺炎及软组织感染著称。随着携带碳青霉烯酶基因的高毒力克隆出现，或多重耐药经典克隆获得毒力质粒，CR-hvKp迅速成为临床防控难点。既往研究已指出，类似pK2044的毒力质粒通常携带rmpADC、rmpA2、iuc、iut、iro以及ter等与高黏液性、荚膜生成、铁摄取和宿主体内适应相关的基因，但这些质粒在不同宿主遗传背景中的表型效应和全局转录调控作用仍不清楚。特别是，在多种临床背景中构建同源的去毒力质粒菌株较为困难，限制了对pVir真实作用的系统评估。因此，本研究开展的意义在于通过精准清除毒力质粒，直接比较其对不同CR-hvKp谱系适应度、毒力性状和转录组重塑的影响，从而阐明质粒编码因子与染色体背景共同塑造致病性的机制。

研究人员选取了两株具有代表性的临床分离株：JNQH373为ST23-KL1、携带bla_NDM-1的高毒力背景菌株，JNQH97为ST11-KL64、携带bla_KPC-2的趋同型耐药高毒力菌株。研究结果表明，pVir是维持CR-hvKp高毒力表型的关键遗传元件，但同时也给宿主细菌带来明显的体外适应度负担。去除pVir后，两株菌均出现生长优势增强、HMV下降、荚膜多糖（capsular polysaccharide，CPS）分泌减少、铁载体分泌减弱以及生物被膜形成增强；在小鼠感染模型中，毒力显著衰减。值得注意的是，ST23-KL1背景即便失去pVir后仍保留较高毒力，说明除质粒外，染色体编码的毒力基础同样重要。研究还发现，不同rmp操纵子在不同谱系中的功能并不完全相同：在ST23-KL1中，rmpADC或rmpA2D2单独回复均可恢复CPS与HMV，而在ST11-KL64中，单独回复不足以完全恢复相关表型，提示荚膜与黏液表型调控具有明显的谱系依赖性。全转录组数据进一步证实，pVir不仅直接提供毒力基因，还深刻影响宿主染色体水平的表达网络，且这种影响在ST11-KL64中更广泛。总体而言，论文确立了pVir在CR-hvKp致病性中的中心作用，并强调毒力质粒效应需要结合宿主基因组背景理解，对开发靶向质粒介导毒力的治疗策略具有重要意义。

作者开展研究所用的关键技术方法主要包括：其一，对来自中国东部三级医院临床样本的两株代表性CR-hvKp分离株进行Illumina短读长与Oxford Nanopore长读长联合测序，并完成混合组装与全基因组生物信息学注释；其二，利用基于CRISPR-Cas9的pCasCure系统精准清除毒力质粒，结合PCR、S1-脉冲场凝胶电泳（S1-PFGE）和重测序验证清除效果；其三，通过生长曲线、拉丝试验、沉降试验、尿囊酸定量、铁载体分泌检测、生物被膜测定及扫描/透射电子显微镜观察评估表型改变；其四，采用小鼠腹腔感染致死模型评价体内毒力；其五，应用RNA测序（RNA-seq）与KEGG通路富集分析比较去除pVir前后的转录组差异，并通过互补实验解析rmp相关操纵子的功能。

以下为研究结果部分的凝练解读，并保留原文小标题。

Bacterial strains
研究人员从约200株临床肺炎克雷伯菌中筛选出两株具有代表性的CR-hvKp分离株。JNQH373属于ST23-KL1，携带bla_NDM-1；JNQH97属于ST11-KL64，携带bla_KPC-2。两者分别代表“高毒力菌株获得耐药基因”与“多重耐药经典菌株获得毒力质粒”这两类趋同进化路径，因此适合用于比较不同遗传背景下pVir的作用。

Genomic characteristics of the CR-hvKp strains
全基因组分析显示，两株菌均携带与原型pK2044高度同源的pVir样质粒，并均具有IncHI1B和IncFIBk复制子。两种pVir都含有rmpADC和rmpA2D2位点，但rmpA2基因均发生截短。JNQH373的pVir还携带iroBCDN，而JNQH97缺失该基因簇；两者均保留iucABCD、iutA和完整ter操纵子。染色体方面，JNQH373携带ICEKp10上的ybt1和clb位点，JNQH97则携带ICEKp3上的ybt3。该结果说明，两株菌不仅毒力质粒构成存在差异，其染色体毒力背景与耐药相关外膜蛋白状态也不同，为后续表型差异提供了解释基础。

Impact of pVir curing on the in vitro fitness and virulence characteristics of CR-hvKp
通过pCasCure系统成功去除pVir后，S1-PFGE证实对应质粒条带消失。生长曲线结果显示，保留pVir的亲本株在MH和DMEM中生长均慢于去质粒株，且在模拟宿主环境的DMEM中差异更明显，说明pVir带来体外适应度负担。表型层面，去除pVir后，两株菌均失去明显HMV表型，黏液性沉降实验和尿囊酸定量进一步证明HMV与CPS均显著下降；CAS平板提示铁载体分泌减少；相反，生物被膜形成增强。电镜观察显示，JNQH373去除pVir后表面出现明显丝状附属结构，TEM证实其长度约0.5 μm–2 μm，符合3型菌毛特征，而JNQH97无论是否去除pVir均未见明显丝状结构。小鼠致死实验表明，两株亲本菌在短期内均导致100%死亡，但去除pVir后，JNQH97在14 d内不致死，JNQH373死亡率亦显著下降但仍保留一定致死性。由此可见，pVir是CR-hvKp高毒力的重要基础，但其失去后残余毒力程度受宿主染色体背景影响明显。

Distinct impact of rmpADC and rmpA2D2 operons on CPS and HMV in CR-hvKp strains
共转录分析证实，rmpADC和rmpA2D2分别构成单一多顺反子转录单位。互补实验显示，在ST23-KL1背景中，无论导入rmpADC还是rmpA2*D2，均足以将HMV和CPS恢复至野生型水平，提示两个操纵子具有功能冗余性。相比之下，在ST11-KL64背景中，单独回复任一操纵子仅能部分恢复CPS，且不能恢复HMV；而嵌合rmpAD2构建体则可完全恢复HMV。这说明不同谱系中rmp调控网络存在显著差异，ST11-KL64对多个调控元件之间的组合关系更为敏感。此外，所有去质粒株及rmp回复株的生物被膜形成均高于亲本株，表明pVir介导的高黏液性状态与生物被膜增强之间可能存在此消彼长的关系。

Impact of pVir curing on the antibiotic susceptibilities of CR-hvKp strains
药敏结果显示，去除pVir前后，两株菌的大多数抗菌药物MIC基本不变，说明pVir对抗菌药物敏感性贡献有限。JNQH97对头孢他啶/阿维巴坦（ceftazidime-avibactam，CAZ/AVI）和氨曲南/阿维巴坦（aztreonam-avibactam，ATM/AVI）敏感，JNQH373因携带bla_NDM-1而对CAZ/AVI耐药，但对ATM/AVI仍表现出活性。时间-杀菌曲线进一步证明，无论是否携带pVir，CAZ/AVI对JNQH97和ATM/AVI对两株菌的杀菌动力学均相近。该结果表明，pVir并不显著改变这些关键药物的体外抗菌效果。

Impact of pVir curing on genome-wide transcription changes
RNA测序结果显示，pVir去除后JNQH373出现549个差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs），而JNQH97达到1,182个，提示ST11-KL64背景受pVir影响更广。两株菌共有的下调基因主要集中于CPS生物合成与多糖输出相关位点，如galF、manC、wzi等，与荚膜下降和HMV减弱的表型一致。KEGG分析显示，两株菌共有的变化包括“多环境微生物代谢”上调与“核苷酸糖生物合成”下调。菌株特异性方面，JNQH373中3型菌毛相关mrkA、mrkC、mrkD、mrkF上调，与电镜观察到的菌毛增多及生物被膜增强相符；而JNQH97中这些基因未呈相同模式，但其生物被膜仍增加，提示可能存在其他替代黏附通路。另一个差异是，VI型分泌系统（type VI secretion system，T6SS）相关基因在JNQH97中明显下调，而在JNQH373中变化不显著。综合来看，pVir既产生跨谱系共有的转录效应，也通过宿主背景塑造明显不同的调控响应。

讨论部分总结
论文讨论指出，pVir是维持CR-hvKp高毒力表型的中心元件，但其携带同时带来代谢与适应度成本。去除pVir后，毒力相关性状整体减弱，而生长优势与生物被膜能力增强，说明质粒介导的高毒力与体外适应之间存在权衡。研究还强调，ST23-KL1在失去pVir后仍残留较强毒力，支持染色体因素如KL/O抗原型、ybt和clb位点等共同参与致病。rmp操纵子功能在不同谱系中的差异，则进一步表明CR-hvKp的荚膜与HMV调控机制具有宿主依赖性。转录组结果揭示，pVir并非仅通过自身编码基因发挥作用，还会广泛重塑宿主代谢、黏附与分泌系统表达。作者同时指出研究局限在于仅分析两株代表菌，且转录组主要基于富营养培养条件，未来仍需纳入更多菌株背景和营养限制环境，以更全面揭示质粒介导毒力与适应的机制。

研究结论部分翻译
综上所述，这些发现全面展示了pVir在CR-hvKp中的功能，并强调塑造致病性的菌株特异性调控复杂性，凸显了制定定制化策略以减轻这一持续演化病原体威胁的必要性。