《mSphere》：Contributions of intestinal protists on the human gut landscape through the lens of Entamoeba spp.
肠道原生动物代表了一个被低估但功能上重要的人类肠道微生物组（gut microbiome）组成部分。历史上被忽视为寄生虫或短暂污染物，许多这些微生物真核生物，特别是Entamoeba属（Entamoeba spp.），现已被认为是肠道生态系统功能和宿主免疫稳态的组成部分。本综述探讨了Entamoeba属在哺乳动物肠道中的复杂作用，将其定位为动态的微生物组"景观塑造者"（landscapers），影响宿主-病原体相互作用、免疫状态（immune tone）和微生物多样性。研究人员探索了Entamoeba对肠道厌氧和免疫活跃环境的进化适应，突出了致病性物种（E. histolytica）和非致病性物种（E. dispar, E. coli）及其独特的免疫调节策略。特别关注E. histolytica塑造的宿主免疫应答，包括炎症小体（inflammasome）激活、巨噬细胞极化和保护性2型应答的抑制。综述还详细描述了Entamoeba与肠道微生物群的相互作用，强调其选择性细菌捕食能力、对微生物群落结构的破坏或增强作用，以及与共生菌和病原体的协同或拮抗关系。方法学挑战在于原生动物检测、基因组注释和培养方面，同时讨论了测序技术、宿主DNA消耗和动物模型方面的 promising 进展。总之，现有证据将Entamoeba属重新定义为不仅仅是病原体，而是关键的生态参与者，其存在可以指示肠道生态系统内的恢复力或易感性。理解肠道原生动物的情境依赖性功能可能为微生物治疗、免疫调节和疾病预防策略提供新见解。
**引言：肠道原生动物是被忽视的肠道微生物组"景观塑造者"**
人类肠道微生物组是生物医学研究的焦点，影响宿主健康、疾病易感性和免疫调节。该生态系统包含细菌、真菌、原生动物、蠕虫和病毒等跨界生物，但研究长期偏重于细菌群落。肠道原生动物在工业化社区个体中丰度较低，传统上被西方生物医学范式视为寄生虫，临床关注局限于致病种如Cryptosporidium parvum、Giardia intestinalis和Entamoeba histolytica。然而，进化历史呈现更复杂的图景：哺乳动物肠道作为独特生态位，具有低氧、营养波动、pH变化、高细胞更新和蠕动机械力等约束条件，驱动了肠道原生动物与宿主的深度共适应。非致病性原生动物在全球健康个体中普遍存在，尤其见于非工业化地区，作为生态系统工程师发挥功能，调节肠道屏障通透性、训练宿主免疫系统、维持微生物多样性并提供抗肠道病原体保护。这一"景观塑造者"功能不限于单一谱系：Blastocystis属与细菌多样性增加和群落结构改变相关；Giardia intestinalis改变营养可利用性、破坏黏液结构并重塑微生物代谢输出；Dientamoeba fragilis与独特微生物组构型相关；Tritrichomonas属则通过与细菌群体和宿主组织的直接跨界相互作用，调节宿主上皮信号、肠道黏膜免疫状态和原生动物代谢重编程。
**研究肠道原生动物的方法学障碍**
寄生虫学领域长期依赖流行区人群调查，虽提供重要流行病学数据，但对宿主-微生物组相互作用机制 insight 有限。16S核糖体RNA（16S rRNA）宏条形码测序针对细菌检测优化，不适合分析微生物真核生物。18S rRNA真核组分析受宿主和膳食植物DNA干扰，可掩盖低丰度原生动物信号。新型宏条形码方法通过有效消耗宿主18S序列提高了可靠性。宏基因组测序（metagenomic sequencing）是有前景的替代方案，但细菌相对高丰度仍是挑战；流式细胞术和优化DNA提取方法可选择性回收和裂解真核细胞，而针对微真核生物鉴定的宏基因组组装流程显著提升了真核组分析的实用性。然而，完整测序和注释的原生动物基因组稀缺，阻碍 robust 生物信息学流程的开发。
实验研究受限于复杂且高度物种特异性的培养系统。原生动物系统发育多样性极高，无通用培养基；现有模型系统如某些肠道原生动物培养需技术专长、试剂批次测试及饲喂细菌补充。更复杂的细胞培养系统如肠道类器官（intestinal organoids）、外植体或芯片上的肠道（gut-on-chip）模型可能用于生理相关共培养实验。体内感染模型开发受宿主物种特异性和复杂生活史重现困难限制；肠道原生动物与复杂细菌群落共进化，物种特异性的人与动物微生物组差异深刻影响定植动态和免疫相互作用，限制发现的可转化性。
**Entamoeba属与哺乳动物肠道**
**Entamoeba生活史及其与人类健康的相关性**
Entamoeba属广泛分布于自然界，多种物种适应特定宿主和生态位。E. histolytica因每年感染约50万至100万人而最为人知，但无症状至轻症病例的漏报使实际数字被 vastly 低估。E. histolytica与其显微镜下无法区分的非致病性近缘种E. dispar常被误诊。美洲E. histolytica/E. dispar合并感染率约9%，男男性行为人群（MSM）中Entamoeba属感染率显著升高（悉尼队列研究显示11.1% vs 0%）。约10% E. histolytica感染发展为阿米巴病（amebiasis），年致死55,000–100,000人，是唯一与肠外疾病相关的Entamoeba种。
感染需摄入粪便污染食水中的感染性包囊（cyst），到达远端小肠后通过脱包囊（excystation）转变为滋养体（trophozoite）。滋养体通过二分裂增殖并定植结肠，在厌氧环境中以细菌为食、降解宿主黏蛋白并摄取铁。在高密度和营养限制信号下，滋养体通过成包囊（encystation）重新形成包囊，随粪便排出完成粪-口传播循环。E. invadens（爬行动物病原体）作为主要体外模型用于研究阶段转换；最近建立的E. histolytica体外成包囊系统拓展了研究途径。
动物模型稀缺：最常见为手术暴露小鼠盲肠或人工结肠袢注射滋养体，可研究阿米巴性结肠炎；经门静脉接种可复制阿米巴肝脓肿。这些模型绕过自然粪-口途径且需专业技能。大鼠经西咪替丁抑制胃酸后可用于口服感染研究。新近开发的E. muris（小鼠共生种）粪-口传播模型可在小鼠中重现完整生活史，用于研究非致病性Entamoeba感染。90% E. histolytica病例无症状，其他非致病种如E. dispar、E. polecki、E. hartmanni和E. coli可在同一宿主共存。美洲E. coli是人类最广泛分布的Entamoeba种（发生率21%）；中非共和国和马达加斯加儿童的真核组研究显示：E. dispar/histolytica占21%，E. coli和E. hartmanni占22%，E. polecki占8%，E. bovis占10%。约四分之一样本存在多种Entamoeba种共感染，提示致病与非致病种共感染可能常见。Entamoeba感染与另一广泛分布的肠道原虫Blastocystis定植正相关，种间原生动物相互作用可能成为新颖研究方向。
**宿主对Entamoeba属的免疫应答**
E. histolytica与宿主免疫系统的相互作用研究最为深入。该寄生虫独特适应于逃逸宿主先天免疫系统，实现长期肠道定植。关键机制为trogocytosis（啃食）：首次在E. histolytica滋养体与Jurkat T细胞共培养中描述，该过程以NOX4依赖方式触发宿主细胞死亡，同时使寄生虫能够摄取并在表面展示宿主免疫调节蛋白如补体调节蛋白CD46和CD59，从而逃避宿主补体系统检测。体液免疫应答差异也影响感染持续性：感染者携带高水平Gal/GalNAc凝集素特异性IgA，在易感孟加拉国儿童队列和肝脓肿康复患者中均显示保护性；该IgA对E. dispar的后续感染有交叉保护。E. histolytica与E. moshkovskii联合免疫BALB/c小鼠产生显著更高IgG应答，E. moshkovskii单独免疫诱导更 robust 持久的抗体应答；此物种特异性效应可能源于抗原蛋白差异——89% E. histolytica特异性单克隆抗体靶向细胞质和细胞骨架蛋白，而73% E. moshkovskii特异性单克隆抗体靶向膜蛋白。
炎症是E. histolytica存活和致病的核心。感染特征为中性粒细胞募集和胞外诱捕网（NETs, neutrophil extracellular traps）释放，形成寄生虫偏好的高炎症微环境。E. histolytica通过形似人趋化因子受体CXCR1的滋养体膜蛋白感知IL-8并向炎症部位迁移。感染还通过caspase-4/1激活和NLRP3炎症小体（NLRP3 inflammasome）募集，超常激活固有层巨噬细胞产生生物活性IL-1β和IL-18。巨噬细胞不仅参与寄生虫诱导的炎症，还影响E. histolytica持续性：早期感染阶段，Gal/GalNAc凝集素C片段通过NF-κB p65和JAK-STAT1信号通路诱导M1巨噬细胞极化（24小时后），表现为NO产生增加及CCL2、CXCL10、CXCL11和促炎基因IL-1β、IL-6转录上调；48小时后同一C片段通过JAK-STAT3和IL-4-STAT6通路诱导M2巨噬细胞极化，精氨酸酶活性和IL-4产生增加。
啮齿动物感染模型对理解致病机制至关重要，但疾病严重程度和免疫应答高度依赖遗传背景。C57BL/6J和BALB/c小鼠对直接盲肠注射E. histolytica天然抗性；但新近E. muris粪-口定植模型在BALB/c小鼠中显示早期CD4
+ T细胞浸润和FoxP3
+调节性T细胞（Tregs）招募驱动的结肠炎样病理。C57BL/6J小鼠的抗性依赖免疫抑制性细胞因子IL-10的产生，可能由CCR9
+ Tregs介导：CCR9
?/?小鼠感染后检测不到盲肠IL-10，表现慢性炎症及IFNγ、TNFα、IL-4、IL-6和IL-17过表达，且CD4
+CD25
+FoxP3
+ T细胞向盲肠上皮和固有层招募延迟，表明早期炎症应答调节缺陷。
与天然抗性品系不同，129S1/SvImJ小鼠对盲肠注射中度易感，CBA/J和C3H小鼠高度易感。CBA/J和C3H小鼠发展为非愈合性慢性肠道病变和更高肠道炎症评分，此现象由T细胞驱动：C3H小鼠CD4
+ T细胞耗竭后寄生虫负荷和炎症降低。T细胞耗竭和T细胞缺陷的BALB/c小鼠均无法支持E. muris持续定植。CBA/J小鼠中E. histolytica快速诱导混合Th2/Th17黏膜免疫表型，盲肠和肠系膜淋巴结中IL-4、IL-5、IL-13、精氨酸酶-1（arginase-1, Arg1）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、IL-17A和IL-23p19表达增加，伴随Th1细胞因子IFN-γ和IL-12p35表达下降，而IL-10基本不变。抗IL-4治疗通过恢复IFN-γ产生实现寄生虫清除，支持侵袭性阿米巴病患者更高血清IL-4水平及儿童更高IFN-γ水平保护作用的临床数据。
经典2型抗寄生虫免疫应答由簇细胞和肠上皮细胞分别分泌IL-25和IL-33启动，两者被2型固有淋巴细胞（ILC2）感知，后者产生IL-4、IL-5和IL-13。这些细胞因子是2型免疫的主要效应物，信号招募嗜酸性粒细胞、促进初始CD4
+ T细胞向Th2分化、并通过隐窝中Lgr5
+干细胞分化扩增簇细胞和杯状细胞。然而，近期研究表明阿米巴性结肠炎中IL-25产生受抑制（人类患者和CBA/J小鼠均如此），而TNFα在人阿米巴性结肠炎活检中升高。重组IL-25治疗促进寄生虫清除并减轻结肠病理，用抗SiglecF单克隆抗体耗竭嗜酸性粒细胞则消除此保护性应答。重组IL-33治疗减轻E. histolytica感染CBA/J小鼠的疾病严重度和寄生虫负荷；但IL-33激活的IL-5
+ ILC2在Rag2
?/?小鼠中通过增加中性粒细胞和嗜酸性粒细胞招募加剧阿米巴肝脓肿形成和严重程度。这些发现支持IL-25和IL-33驱动的2型免疫应答特异性保护肠道E. histolytica感染，而寄生虫对此应答的失调可能促进阿米巴性结肠炎发展的模型。
关于非致病性Entamoeba种的免疫调节效应所知甚少。E. dispar不像E. histolytica诱导NET形成，提示两者固有毒力和致病潜力差异。随着非致病性Entamoeba种持续在全球健康个体中被检测到，解析其免疫学足迹将为宿主-原生动物相互作用谱系及肠道健康和疾病恢复力的相关性提供关键见解。
**Entamoeba属与肠道微生物组**
作为原生肠道细菌的捕食者，Entamoeba属有改变肠道微生物组组成和功能的能力。定植诱导的组成变化很大程度上取决于地域、宿主健康状态和饮食。哥伦比亚日托儿童研究中，非致病种E. coli增加微生物组丰富度，与Akkermansia、Coprococcus和Alistipes属富集正相关。非洲农村不同生计方式人群比较研究发现，Entamoeba定植与α多样性增加、β多样性降低和微生物组成显著改变相关。α多样性增加亦见于其他非致病原虫如Blastocystis、Endolimax nana和Dientamoeba fragilis定植个体，而Cryptosporidium感染则报告α多样性降低。Entamoeba定植个体中降低的β多样性可能指示朝向共享微生物群落结构的汇聚，与Entamoeba及肠道原虫的潜在生态系统塑造作用一致。该研究中Entamoeba阳性个体还显示与炎症性肠病（inflammatory bowel disease, IBD）和自身免疫疾病相关的独特微生物组成特征：E. histolytica/dispar存在与Clostridiales Ruminococcaceae显著正相关，而后者在IBD个体中欠表达；E. histolytica/dispar定植还与类风湿关节炎相关的Prevotella copri和结直肠癌相关的Fusobacteria流行率降低相关。
肠道微生物组变化也与阿米巴病相关。日本比较侵袭性和无症状E. histolytica感染的研究发现，β多样性在两群体间显著不同：无症状个体携带更均一的微生物组。OTU分析显示，无症状感染者Streptococcaceae比例显著低于侵袭性疾病患者；而Ruminococcaceae、Coriobacteriaceae和Clostridiaceae等有益菌科比例显著更高。种水平上，Collinsella aerofaciens在无症状个体中显著富集，而Streptococcus salivarius和Streptococcus sinensis显著降低。BALB/c小鼠E. muris感染结肠炎模型也描述显著细菌组成变化：感染降低18种不同细菌丰度，其中10种属厚壁菌门（Firmicutes）。这些发现提示有益菌丧失和潜在加剧菌增加可能是侵袭性疾病发展的促成因素。
体外细菌-阿米巴相互作用研究提供了关于这些复杂且常具保护性的跨界相互作用的宝贵见解。E. histolytica与多种肠道细菌共培养实验发现，其优先吞噬Lactobacillales、Erysipelotrichales、Clostridales和Bifidobacteriales科的共生细菌，对L. ruminus显示显著偏好。肠道中细菌主要以生物膜（biofilm）形式存在于复杂微生物群落中，生物膜赋予对环境损伤、宿主免疫攻击和抗菌药物的独特保护。以Bacillus subtilis为模型的近期研究表明，E. histolytica通过分泌半胱氨酸蛋白酶以消化性自噬（digestive autophagy）方式适应于捕食肠道细菌生物膜，使其能够黏附并分解细菌生物膜胞外基质。这些相互作用仅对阿米巴有利：黏附生物膜使其获得抗氧化应激保护，而分泌的阿米巴产物则恢复生物膜的抗生素敏感性。
Entamoeba生物学不仅受与其他细菌的直接相互作用影响，还受其代谢产物影响。E. histolytica与肠致病性大肠杆菌O55共培养增强寄生虫对氧化应激的抗性，通过大肠杆菌来源的草酰乙酸（oxaloacetate）实现。活体E. coli O55暴露还显著增强寄生虫超扩散运动性（superdiffusive motility），导致更广泛分散和更广泛的细胞破坏；但该表型是否也由大肠杆菌代谢产物诱导尚不清楚。共生菌产生的短链脂肪酸（short-chain fatty acids, SCFAs）也以宿主特异性方式差异诱导Entamoeba阶段转换：丁酸盐（butyrate）阻止E. invadens体外成包囊但对E. histolytica无显著影响；乙酸和丙酸则诱导E. histolytica更早体外成包囊。这些发现提示宿主特异性细菌微生物组及其代谢产物可对Entamoeba属产生独特生物学效应。
**结论**
哺乳动物肠道代表自然界最复杂动态的微生物生态系统之一，但其真核成员的完整多样性及其对肠道稳态和疾病的贡献仅最近才开始被认识。本综述强调，长期被 relegated 于寄生虫学和病理学领域的Entamoeba属，正成为微生物组景观中的 nuanced 参与者。远非统一致病，许多Entamoeba种在无临床后果的情况下定植健康个体，在某些情境下甚至可能促进肠道稳态和微生物多样性。这些发现挑战了原生动物仅为有害入侵者的长期假设，支持更广泛的生态框架，其中Entamoeba属可既作为破坏者又作为肠道地形重塑者。
Entamoeba属作为潜在病原体和共生体的二元性，反映了其对由免疫、营养和微生物约束塑造的宿主环境的精细适应。E. histolytica逃逸先天免疫应答、利用宿主炎症并策略性捕食定居微生物群的能力，体现了其进化特化。但其近缘种如E. dispar、E. coli和E. moshkovskii似乎缺乏这些毒力特征，反而与多种人类群体的微生物丰富度和稳定性增加相关。这种功能分歧提出了关于致病性分子决定因素以及调控疾病出现与耐受的情境因素的关键问题。
宿主免疫在介导这些结果中发挥决定性作用。从E. histolytica入侵所需的高炎症微环境到阿米巴性结肠炎期间被破坏的保护性IL-25和IL-33介导的信号级联，宿主应答不仅是防御机制，更是塑造原虫生态位的复杂调控力量。不同遗传易感性的小鼠模型揭示细胞因子状态、巨噬细胞极化和调节性T细胞动态显著影响感染轨迹。这些见解对开发靶向治疗和疫苗策略至关重要，需强化保护性免疫通路同时避免附带炎症。
Entamoeba栖息的微生物群落同等重要。从选择性吞噬共生菌到协同调节生物膜群落，Entamoeba与肠道细菌的双向相互作用表明，原虫定植不能孤立理解，而必须置于更广泛的微生物竞争、合作和宿主介导反馈网络中考虑。值得注意的是，无症状与侵袭性E. histolytica感染的微生物组组成存在一致可测量的差异，暗示可能缓冲或促进疾病的微生物组构型。这些关联可能扩展至共同定植的原虫如Blastocystis和Dientamoeba fragilis，它们频繁在携带肠道原虫的人群中被检测到且地理分布广泛；新兴数据指向Entamoeba属与Blastocystis之间可能的种间协同作用。
尽管取得进展，Entamoeba属理解中的重大差距仍然存在。检测、分类和实验操作的方法学局限持续阻碍进展。作为四倍体生物，基因编辑和敲除研究遗传上尚不可行，但RNA干扰等遗传工具的最新发展正为功能缺失研究和正向遗传学方法开辟更多途径。测序技术、宿主DNA消耗方案和针对Entamoeba属及其他真核生物的生物信息学工具的持续创新，对推进原生动物学研究至关重要。此外，在临床和流行病学研究中将原生动物纳入常规微生物组分析，将是重新定义跨群体基准健康和疾病基准的关键。
Entamoeba属例证了将肠道微生物组理解为真正跨界生态系统的必要性。其作为免疫调节者、微生物雕刻者和潜在疾病放大者的角色是情境依赖性的，与宿主及其微生物环境错综复杂地联系在一起。认识到肠道原生动物不仅仅是病原体而是生态参与者，为肠道健康、恢复力和治疗操作的研究开辟了新途径。随着微生物组科学持续扩展其范围，将原生动物纳入其核心对于更全面理解塑造肠道稳态和疾病状态的微生物相互作用至关重要。当我们拥抱这些古老、复杂且常被误解的肠道景观栖息者时，肠道微生物组研究的未来将更加丰富、准确和整合。
