锌功能化生物陶瓷的高通量合成推动骨植入物的理性设计

《Bioactive Materials》：High-throughput synthesis of zinc-functionalized bio-ceramics propels the rational design of bone implants

　　

赋予基础陶瓷功能元素可有效改善其理化及生物学性能。然而，这些性能受粒径、热力学和动力学条件以及晶格结构的强烈影响。此类复杂性需要大量的试错优化，严重制约了材料开发效率。为克服这一挑战，研究人员建立了一个高通量合成平台，通过独立调控18个反应时间和48个反应温度，实现多达144个实验的并行执行，从而精确控制锌掺杂磷酸钙（Zn-CaPs）的形貌和晶相。研究人员系统研究了体系浓度、锌/钙比、pH、反应时间、温度以及二元溶剂浓度影响Zn-CaPs结晶的潜在机制。所制备的Zn-CaPs表现出优异的细胞相容性、成骨生物活性和抗菌性能。由Zn-CaPs制备的多孔支架（Zn-CaPS）强度超过商用CaPs支架的两倍以上。值得注意的是，在兔股骨缺损模型中植入6周和12周后，Zn-CaP支架的骨体积分数（BV/TV）分别比对照组和商用CaPs支架高出4倍和2倍以上。该工作开发了一种面向高性能离子掺杂生物陶瓷的创新型材料基因组框架，整合高通量设计、合成与性能评价以加速研发并产生社会经济效益。

## 研究背景与问题

传统材料开发流程需要数十年才能筛选出适于技术应用的新型材料，而将其优化用于工业实施则需要更长时间。在生物材料合成过程中，研究人员通常基于实验经验和现有文献来调控相关参数。这种传统的试错法合成生物材料效率低下、成本高昂且耗时费力，难以将实验参数与实验结果建立关联。此外，传统合成技术因试剂批次、反应时长和环境温度的差异而影响所制备材料的均一性。受人类基因组计划启发，"材料基因组计划"（Material Genome Initiative, MGI）整合高通量计算、实验和专用材料数据库，以革新材料开发模式，针对传统研发效率低下的问题，加速材料发现、商业化部署并降低成本。"材料基因组技术"旨在利用高通量实验设备分析材料基因芯片并构建全面材料数据库以加速材料发展。高通量技术依赖于快速开展多项并行实验的能力，但目前主要应用于半导体、陶瓷和纳米材料领域，直到近期才开始应用于新型生物材料及其在再生医学中潜在应用的结构或基质创建。

生物陶瓷材料通常通过水热法（hydrothermal method）制备，该方法无需高温烧结即可形成晶态粉末，具有能耗低、产率高和制备工艺简单等优势。此外，采用水热技术制备的生物陶瓷其生物学性能和应用范围可得到大幅提升。然而，该方法的合成过程受反应时间、温度、pH、元素种类及比例等多种因素影响，采用高通量技术可显著提高水热合成效率。据研究人员所知，目前尚未有水热技术应用于高通量生物陶瓷合成的研究报道。钙磷酸盐（CaPs）是人体硬组织中的主要无机矿物质，对机体支撑、器官保护和血液生成至关重要。尽管CaPs具有诸多优异性能，但其脆性大、强度低、韧性差及生物学功能有限等缺点制约了其满足各种临床治疗需求的能力。研究表明，将CaPs与聚合物和生长因子结合可克服上述局限。低浓度功能离子在骨组织修复中较蛋白类生长因子具有成本和稳定性优势。

锌离子（Zn²⁺）因对生物体代谢、生长和发育的关键作用而被称为"21世纪的钙"，锌基可降解材料因其生物相容性和再生特性而备受关注。Zn²⁺的杀菌、成骨和心脏功能保护作用已得到充分证实。因此，将Zn²⁺加入CaPs可增强其生物学功能，赋予其优异的成骨、血管生成和抗菌性能。然而，目前对Zn²⁺在羟基磷灰石（HA）向β-磷酸三钙（β-TCP）转化中作用的理解仍不充分，限制了对其生物学效应的深入认识。

## 研究开展与主要结论

研究人员构建了具有144个反应位点、48个温度梯度和18个时间梯度的高通量合成装置，以Zn²⁺修饰CaPs为研究主题，结合高通量技术与水热法系统研究Zn²⁺对CaPs理化性能和生物学功能的影响。研究聚焦于Zn-CaPs的细胞相容性、成骨分化和抗菌效应，并深入分析了采用3D打印技术构建的Zn-CaPS的理化性能及体内骨再生效应。

### 高通量筛选氨含量与反应物浓度

研究人员首先同时分析了氨含量和反应物浓度对Zn-CaPs晶体形成的影响。扫描电子显微镜（SEM）结果显示，氨含量显著改变合成CaPs的微观形貌：随氨含量增加，Zn-CaPs形貌由团聚体转变为立方颗粒，进而逐渐碎裂为不规则纳米颗粒；而体系浓度（Zn²⁺+Ca²⁺的总浓度）增加则诱导相反的形貌演变。X射线衍射（ streetfighter 分析表明，无氨或低氨反应体系中主产物为磷酸氢钙（CaHPO₄，磷钙石）；氨含量增加使主衍射峰与β-Ca₃(PO₄)₂（β-TCP）匹配；进一步升高氨含量最终生成低结晶度羟基磷灰石（Ca₁₀(PO₄)₆·(OH)₂，HA）。相反，Zn-CaPs相组成随体系浓度增加呈现相反趋势。

基于过饱和度理论，研究人员阐明了上述现象的机制：结晶成核由过饱和度驱动以克服能垒，更高过饱和度加速结晶并促进晶体生长，但过量过饱和度超出亚稳区限值会引发爆发性成核，耗尽游离Ca²⁺和磷酸根离子，形成小而规则的组合纳米颗粒。无氨条件下，OH^-通过H₂O电离形成，体系严重缺乏OH^-，导致低焓CaHPO₄优先沉淀；Zn²⁺掺杂诱导优先沿(0210)、(128)、(214)、(220)、(1010)和(4010)晶面生长，形成立方β-TCP。氨含量升高提高c(OH^-)/c(Ca²⁺+Zn²⁺)比值，促进产物过饱和度和生成焓，推动CaHPO₄向高焓β-TCP转化；进一步增加氨含量使比值过高，导致快速成核沉淀高焓球形HA纳米颗粒。体系浓度则对产物过饱和度和生成焓产生相反影响。

傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析确认了所有样品的特征CaP吸收峰。原子吸收光谱（AAS）显示，固定体系浓度下锌掺杂效率随氨水添加量增加而降低；恒定氨水平下，掺杂效率随体系浓度升高而增加，这与Zn²⁺与氨形成锌-氨配合物[Zn(NH₃)₄]²⁺而滞留于溶液中的机制相符。

### 高通量筛选反应温度与时间

研究人员选择10Zn-M0.5A0.2、10Zn-M0.5A1.0和10Zn-M0.5A2.0考察反应温度和时间对Zn-CaP形貌、相组成和Zn²⁺掺杂效率的影响。结果表明，反应时间和温度对Zn-CaP形貌的调控具有一致性。随反应时间和温度增加，10Zn-M0.5A0.2的层状结构缩短并最终消失，产物由大颗粒团聚体转变为小颗粒团聚体；10Zn-M0.5A1.0由球形颗粒和长层状结构演变为边缘清晰的 elongated 条状结构，最终形成立方颗粒；10Zn-M0.5A2.0则由条状纳米颗粒和层状结构变为球形纳米颗粒，此后无进一步形貌变化。

XRD确认未反应样品分别呈现磷钙石、透钙磷石（brushite）和HA相，而随反应温度和时间增加，10Zn-M0.5A0.2逐渐由磷钙石转变为透钙磷石再回归磷钙石；10Zn-M0.5A1.0由透钙磷石转变为β-TCP；10Zn-M0.5A2.0则保持HA为主相不变。这是因为HA是热力学最稳定的晶态CaP盐，升高温度或延长时间不足以诱导其相变。透射电子显微镜（TEM）图像显示不同样品具有 distinct 的晶体表面结构，能谱分析（EDS）面扫揭示了Ca、P、O和Zn在表面的均匀分布。

### 高通量筛选Zn含量

以M0.5A1.0条件制备的样品为对象，研究Zn添加量对形貌、相和掺杂效率的影响。随Zn掺杂增加，Zn-CaPs结构由棒状纳米颗粒转变为棒状纳米颗粒团聚体，其中棒状纳米颗粒逐渐融合形成结晶表面，进一步发育为完整立方颗粒。XRD分析表明，0Zn-M0.5A1.0主相为磷钙石；引入Zn²⁺使相转变为β-TCP，这是由于Zn²⁺对β-TCP的稳定作用；随Zn添加量增加，相最终转变为磷锌矿（scholzite，CaZn₂(PO₄)₂·2H₂O）。X射线衍射Rietveld精修结果显示，晶格参数（a, c）和晶胞体积随Zn掺杂量增加逐渐减小，这与Ca²⁺（离子半径1.00 ?，配位数CN=6）被更小的Zn²⁺（0.74 ?，CN=6）取代导致的晶格收缩一致。X射线光电子能谱（XPS）确认了Ca 2p和Zn 2p的特征结合能位移，表明Zn²⁺通过化学键合而非单纯物理吸附进入晶格。

### 高通量筛选二元溶剂系统

有机共溶剂对水溶液结晶的调控可实现纯水系中无法实现的材料形貌、结构和组成定制设计。研究人员建立二元溶剂浓度梯度，考察不同乙醇/水体积比对CaPs合成的影响。SEM显示，反应前Zn-CaPs形貌由球形纳米颗粒演变为不规则层状和块状结构，最终形成由纳米颗粒组装的多孔微球团聚体；反应后则呈现 distinct 层状结构。随无水乙醇/去离子水体积比降低，层状结构逐渐减弱并增大；进一步降低则转变为纳米颗粒组装团聚体并随水含量增加而长大。

XRD显示，所制备Zn-CaPs的主相随无水乙醇/水比降低由磷钙石转变为β-TCP；反应后则完全由β-TCP转变为以磷钙石为主相，磷锌矿次相也稳步减少。有机溶剂促进亚稳相形成，归因于醇羟基与酸基氧原子间的氢键以及羟基氧原子与Ca²⁺之间的静电作用延迟了晶相析出。

### 生物学性能评价

研究人员选择10Zn-M0.5A0.2、10Zn-M0.5A1.0和10Zn-M0.5A2.0验证Zn-CaPs的生物学功能。细胞相容性实验通过与MC3T3-E1细胞共培养离子浸提液评估，结果显示各组均具有优异细胞相容性，其中10Zn-M0.5A0.2和10Zn-M0.5A1.0效果更优，可能归因于其更高的Zn²⁺和Ca²⁺释放量。

成骨分化潜能通过实时定量聚合酶链式反应（RT-PCR）和蛋白质印迹法（Western blot）检测成骨相关蛋白和基因表达。RT-PCR结果显示10Zn-M0.5A1.0组成骨相关基因水平高于其他组；Western blot结果一致。免疫荧光Runx2和骨钙素（OCN）染色及碱性磷酸酶（ALP）染色结果证实Zn²⁺增强了CaPs促进骨髓间充质干细胞（BMSCs）成骨分化的能力。然而，10Zn-M0.5A2.0的Runx2和OCN表达低于对照组，可能因其较高Zn²⁺释放量对成骨相关蛋白表达产生抑制。

抗菌活性通过将离子浸提液与大肠杆菌（E. coli）和金黄色葡萄球菌（S. aureus）共培养24小时评估。结果证实Zn²⁺掺入增强了CaPs的抗菌活性，且OD值随Zn²⁺释放量增加而递减，表明Zn²⁺抑制细菌增殖。

### 3D打印Zn-CaPs支架构建及力学性能

5Zn-M0.5A1.0、10Zn-M0.5A1.0和20Zn-M0.5A1.0通过3D打印制备成多孔支架（5Zn-β-TCPS、10Zn-β-TCPS、20Zn-β-TCPS）。烧结后所有支架保持孔隙结构，孔径约400-500 μm。XRD显示烧结后支架中磷钙石和磷锌矿相消失，以β-TCP为主相，并生成少量焦磷酸钙（Ca₂P₂O₇）；10Zn-β-TCPS和20Zn-β-TCPS中检测到少量焦磷酸锌（Zn₂P₂O₇）。

力学测试显示10Zn-β-TCPS具有最高抗压强度， attributed to 其最均匀的粒径分布。20Zn-β-TCPS抗压强度最低，归因于其高Zn²⁺掺杂量诱导的相变。各支架孔隙率均超过80%，Zn-β-TCPS抗压强度超过0.5 MPa，满足承重骨修复支架的力学强度要求。Ashby图比较显示，常规结构的10Zn-β-TCPS在86%高孔隙率下仍保持2.68 MPa的相对高抗压强度。雷达图系统总结表明，10Zn-β-TCPS在抗压强度、孔隙率、细胞相容性、成骨活性和可加工性方面均优于其他CaPs支架。

### 体内成骨性能

通过兔股骨缺损模型评估商品化聚乳酸支架（PLAS）、β-TCPS和10Zn-β-TCPS的性能。Micro-CT显示10Zn-β-TCPS组在6周和12周时的新生骨形成均多于对照、PLAS和β-TCPS组。定量分析表明，10Zn-β-TCPS组在6周和12周时的骨体积分数（BV/TV）、骨矿物质密度（BMD）和骨小梁数量（Tb.N）均为四组最高。值得注意的是，10Zn-β-TCPS组BV/TV分别比对照组和β-TCPS组高出4倍和2倍以上。

组织学苏木精-伊红（H&E）染色和马松（Masson）三色染色显示，10Zn-β-TCPS组新生骨形成最多，骨成熟度最高。免疫组化（IHC）染色检测骨特异性蛋白OCN和Runx2的表达，结果显示10Zn-β-TCPS组表达水平最高，证实Zn²⁺增强了β-TCPS的成骨分化能力。

## 讨论与研究结论

材料研发始于材料设计方法学。材料基因组学代表了一种材料开发研究模式，而可靠的高效材料构建方法不可或缺。先进材料合成与筛选技术对材料设计至关重要，可加速设计进程、缩短研发时间并确定最佳条件和参数。本研究通过自建高通量合成系统结合水热法实现了Zn-CaPs的高通量制备，该策略较传统烘箱或多站反应器具有更高的制备效率，且合成样品具有高重现性。该平台能够同时考察多种工艺参数对目标材料理化性能的影响，并基于过饱和度理论阐明了这些参数对Zn-CaP结晶的影响机制。Zn²⁺掺杂显著增强了Zn-CaPs的生物学功能，10Zn-β-TCPS较纯β-TCPS具有显著更高的机械强度。Zn-CaPs在生物医学应用领域展现出巨大潜力。

该研究的局限性在于：仅 investigated 了单一微量元素（Zn）对CaPs理化性能和生物学功能的影响，反应时间、温度和二元溶剂条件的研究节点不足；反应参数（包括Zn²⁺）调控的具体结晶机制尚不明确；高通量材料合成与最优生物学性能之间的关联缺乏充分实验支持。未来工作将探索多种离子的协同效应及多微量元素共掺杂对CaP理化性能和生物学性能的增强作用，确定多元素改性CaPs高效生物学功能（药物递送、抗菌活性、抗肿瘤功效和成骨作用）的最优掺杂含量，整合XRD/Raman分析与计算模拟以进一步阐明潜在结晶机制，从而丰富材料数据库并加速生物功能材料的开发。

**研究结论**：在本研究中，研究人员采用高通量合成设备评估了体系浓度、氨浓度、反应时间、温度、锌浓度和二元溶剂对水热法合成Zn-CaPs的形貌、相、化学结构和锌掺杂率的影响。合成所得Zn-CaPs在体外表现出优异的细胞相容性、成骨分化和抗菌性能。此外，3D打印支架（10Zn-β-TCPS）表现出增强的机械强度和优于传统CaPs支架（无锌CaPs）的股骨缺损修复效果，凸显其在承重骨再生中的潜力。该研究建立了用于合成具有定制形貌和结构的高性能离子掺杂CaPs的多功能高效平台。未来人工智能驱动的材料设计与高通量技术的整合有望实现材料成分、结构和性能的预测，从而推进可控合成及新型材料的快速发展。