贝福替尼对ABCG2依赖性药物外排的抑制作用恢复耐药非小细胞肺癌细胞的化疗敏感性

《Biomedicine & Pharmacotherapy》：Attenuation of ABCG2-dependent drug efflux by befotertinib restores chemosensitivity in multidrug-resistant non-small cell lung cancer cells

　　

化疗失败仍然是癌症治疗中的一个主要挑战，多药耐药（MDR）是最显著的影响因素之一。MDR的一个关键机制涉及ATP结合盒（ABC）转运蛋白的过度活性，这些转运蛋白利用ATP水解将大量抗癌药物主动排出肿瘤细胞，从而减少细胞内药物积累并降低治疗效果。尽管已广泛开发针对这些转运蛋白的新型抑制剂，但少有临床有效药物出现，这凸显了需要替代策略，例如重新利用具有良好安全性的靶向疗法来调节药物外排。在本研究中，研究人员评估了贝福替尼（befotertinib，D-0316），这是一种由国家药品监督管理局（NMPA）批准的第三代表皮生长因子受体（EGFR）酪氨酸激酶抑制剂（TKI），其克服ABCG2介导的耐药性的能力。在非细胞毒性浓度下，贝福替尼显著使过表达ABCG2的非小细胞肺癌（NSCLC）细胞对作为ABCG2底物的化疗药物重新敏感，并以浓度依赖性方式增强药物诱导的凋亡。功能实验表明，贝福替尼抑制ABCG2介导的药物外排，而不改变转运蛋白表达水平。机制分析进一步显示，贝福替尼刺激ABCG2 ATP酶活性，而分子对接预测其在ABCG2底物结合口袋内稳定结合，暗示与涉及转运蛋白功能的关键残基直接相互作用。通过这一机制，贝福替尼作为ABCG2的功能性抑制剂，恢复细胞内药物积累并增强细胞毒性反应。总体而言，这些发现表明，在具有高ABCG2表达的NSCLC中，贝福替尼可作为化疗增敏剂以克服MDR，支持其在联合治疗策略中的进一步评估。

**论文解读文章**

**研究背景、存在问题与研究目的**

多药耐药（MDR）是癌症化疗失败的主要障碍之一，其关键机制涉及ATP结合盒（ABC）转运蛋白的过度活性，特别是ABCB1（P-糖蛋白）和ABCG2（乳腺癌耐药蛋白，BCRP）的过表达，这些蛋白通过ATP水解将结构多样的抗癌药物排出细胞，降低细胞内药物浓度，从而削弱治疗效果。在非小细胞肺癌（NSCLC）中，ABCG2的高表达与较差的治疗响应和预后相关。尽管已开发多代ABC转运蛋白抑制剂，但因其毒性、药代动力学干扰或选择性不足等问题，尚无药物获得监管批准。因此，重新利用已临床验证的靶向疗法作为调节转运蛋白活性并恢复药物敏感性的策略变得日益重要。贝福替尼（befotertinib）是一种口服、不可逆的第三代表皮生长因子受体（EGFR）酪氨酸激酶抑制剂（TKI），已在中国获批用于治疗EGFR突变的NSCLC。本研究旨在探究贝福替尼是否能影响ABCG2介导的耐药性，从而作为化疗增敏剂发挥作用，为克服NSCLC中的MDR提供新途径。

**所开展的研究、结论及重要意义**

研究人员通过体外细胞模型验证了贝福替尼对ABCG2依赖性药物外排的抑制作用及其恢复化疗敏感性的能力。研究发现，ABCG2过表达不影响贝福替尼本身的细胞毒性；在非毒性浓度下，贝福替尼以浓度依赖性方式显著增强ABCG2过表达的NSCLC细胞对ABCG2底物化疗药物（米托蒽醌、SN-38、拓扑替康）的敏感性，并促进药物诱导的凋亡。机制上，贝福替尼不改变ABCG2蛋白表达或分布，而是直接抑制转运功能，增加底物药物在细胞内的积累。进一步生化分析显示，贝福替尼以双相方式刺激ABCG2 ATP酶活性，分子对接预测其占据ABCG2底物结合腔，与Phe439、Met549、Val546等关键残基形成稳定互作。这些结果明确表明，贝福替尼作为一种候选ABCG2功能调节剂，能够恢复耐药NSCLC细胞对化疗的敏感性。该发现揭示了贝福替尼超越EGFR抑制的额外药理特性，即干扰转运蛋白介导的药物外排，支持其在联合化疗中克服ABCG2相关MDR的潜在价值。论文发表在《Biomedicine》。

**主要关键技术方法**

本研究未涉及临床样本队列，主要细胞来源包括：美国国立癌症研究所（NCI，NIH，Bethesda， MD， USA）提供的NSCLC细胞系H460、A549及其ABCG2过表达耐药亚系H460-MX20、A549-Bec150，以及稳定转染ABCG2的HEK293细胞（R482-HEK293）。关键技术方法包括：采用基于MTT/CCK-8法的细胞毒性及药物敏感性测定以评估IC₅₀值；通过Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测凋亡；利用免疫印迹（Western blot）和免疫荧光显微镜分析ABCG2蛋白表达与定位；以荧光底物脱镁叶绿酸A（PhA）结合流式细胞术进行药物积累实验；通过钒酸盐敏感染ATP酶活性测定检测贝福替尼对ABCG2 ATP水解的影响；采用分子对接模拟（CDOCKER算法）基于ABCG2冷冻电镜结构（PDB: 6VXH）预测结合模式。报告明确排除试剂和具体培养、质粒构建操作细节。

**研究结果**

**3.1 贝福替尼的活性不受ABCG2过表达影响**：通过比较亲代NSCLC细胞（A549、H460）及其ABCG2过表达亚系（A549-Bec150、H460-MX20）以及工程化HEK293模型（pcDNA3.1-HEK293 vs. R482-HEK293）的细胞毒性实验，证明贝福替尼在ABCG2过表达细胞中与亲代细胞具有相似的生长抑制效力，说明ABCG2不高效外排贝福替尼。

**3.2 贝福替尼以浓度依赖性方式逆转ABCG2介导的MDR**：在非毒性浓度（0.1–1 μM）下，贝福替尼显著增加ABCG2过表达细胞（H460-MX20、A549-Bec150、R482-HEK293）对ABCG2底物药物（米托蒽醌、SN-38、拓扑替康）的敏感性，表现为IC₅₀值降低且折叠逆转（F.R.）值呈浓度依赖性增加，类似于阳性对照Ko143的作用。

**3.3 贝福替尼增强ABCG2过表达的NSCLC细胞中化疗药物诱导的凋亡**：流式细胞术分析显示，在H460-MX20和A549-Bec150细胞中，贝福替尼（1 μM）与拓扑替康联用时，晚期凋亡细胞比例显著高于拓扑替康单药组（H460-MX20: 约22% vs. 11%；A549-Bec150: 约27% vs. 7%），而贝福替尼单独处理不显著诱导凋亡。

**3.4 贝福替尼不影响ABCG2蛋白丰度或细胞内分布**：通过免疫印迹和免疫荧光分析，72小时贝福替尼处理后，ABCG2蛋白表达水平及膜定位均未发生可检测变化，表明其逆转MDR不通过下调表达或影响运输。

**3.5 贝福替尼抑制ABCG2介导的药物转运**：短时（1小时）药物积累实验显示，贝福替尼（1 μM）显著增加ABCG2过表达细胞（H460-MX20、A549-Bec150、R482-HEK293）内荧光底物PhA的积累，效果与Ko143类似，而亲代细胞无明显变化，证实贝福替尼直接抑制ABCG2外排活性。

**3.6 贝福替尼对ABCG2相关ATP水解的影响**：ATP酶活性测定采用富含重组人ABCG2的昆虫细胞膜制备物，结果显示贝福替尼以浓度依赖性方式刺激钒酸盐敏感性ATP酶活性，在约1 μM时达到最大激活，随后下降至基线水平（55.00 ± 2.01 nmol Pi/min/mg蛋白），呈双相反应模式，表明贝福替尼与ABCG2底物结合区直接互作。

**3.7 贝福替尼在ABCG2药物结合口袋内的计算机模拟对接分析**：基于ABCG2内向冷冻电镜结构（PDB: 6VXH）的分子对接显示贝福替尼占据中央底物结合腔（Cavity 1），通过π–π堆积与Phe439'（另一单体的残基用撇号标注）相互作用，并通过π–烷基作用与Met549、Val546及Val546'、Met549'等残基形成稳定网络，特别是与Met549'的预测氢键进一步稳固结合，支持其竞争性抑制底物转运的结构基础。

**讨论总结与结论翻译**

在讨论部分，研究人员指出ABCG2通过外排多种抗癌药物导致治疗失败，而现有抑制剂因毒性和药代动力学问题未能临床转化。重新利用已获批靶向药物如贝福替尼是一种有前景的策略。本研究证实贝福替尼不降低ABCG2表达，而是通过占据底物结合口袋、刺激ATP酶活性来直接抑制转运功能，从而恢复耐药细胞的化疗敏感性。分子对接揭示了与Phe439等关键残基的紧密互作，解释了其抑制作用。研究人员强调，这些发现虽然支持贝福替尼作为MDR调节剂的潜力，但仍需体内外验证和药代动力学评估，以确定联合用药的安全性和有效性。

**结论翻译**：总之，本研究将贝福替尼鉴定为一种潜在的ABCG2功能调节剂，能够恢复耐药NSCLC模型中的化疗敏感性。由于贝福替尼是为NSCLC开发的，本研究聚焦于NSCLC MDR模型。然而，ABCG2介导的耐药性不仅限于肺癌。未来研究应确定贝福替尼是否能同样恢复ABCG2过表达的结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌和血液肿瘤模型中的化疗敏感性。在获得这些研究结果之前，贝福替尼应被描述为候选ABCG2调节剂，而非通用ABCG2抑制剂。这些结果不仅支持其在联合策略中的进一步开发，也强化了重新利用酪氨酸激酶抑制剂作为克服肿瘤中转运蛋白介导的多药耐药的工具这一更广泛的概念。