嘌呤衍生物作为抗查加斯病潜在药物：离体（ex vivo）、体外（in vitro）与计算机模拟（in silico）评价及其在克氏锥虫（Trypanosoma cruzi）中的靶标鉴定

《Biomedicine & Pharmacotherapy》：Purine derivatives as potential agents against Chagas disease: Ex vivo, in vitro, in silico evaluation, and identification of targets in Trypanosoma cruzi

　　

查加斯病由克氏锥虫（Trypanosoma cruzi）引起，影响全球数百万人，但目前可用药物苄硝唑（benznidazole，Bzn）和硝呋莫司（nifurtimox，Nfx）在疾病不同阶段疗效不稳定，且具有显著毒性，因此治疗仍不充分。鉴于嘌呤核苷类似物已显示出抗锥虫活性，并且可能作用于寄生虫关键蛋白，例如 cruzipain（TcCZP）和溴结构域因子2（bromodomain factor 2，TcBDF2），本研究旨在通过离体（ex vivo）、体外（in vitro）和计算机模拟（in silico）方法，确定20种嘌呤衍生物是否具有与这些靶标相关的抗寄生虫特性。结果表明，在针对两种墨西哥克氏锥虫循环血流锥鞭毛体株（NINOA 和 INC-5）的筛选实验中，根据半数致死浓度（LC₅₀）数值，这些嘌呤中的大多数优于参比药物 Nfx 和 Bzn；其中，NINOA 株的 LC₅₀ 范围为 6.28–144?μM，INC-5 株的 LC₅₀ 范围为 18.42–166.87?μM，活性最强的嘌呤为 9e、9i、9j、9m、9n 和 9t。构效关系（structure-activity relationship，SAR）分析解释了嘌呤骨架中某些片段对杀锥虫效应的影响。随后，研究人员将筛选出的嘌呤化合物用于细胞内 Tulahuen-2 无鞭毛体实验，其中有4种化合物在低于 10 μM 的浓度下表现出活性，且 9m 的效力约为 Bzn 的 1.5 倍。由于所测嘌呤化合物对 TcCZP 的抑制活性较低（最优化合物 9j 的 IC₅₀ 为 87.1?μM），因此排除了该靶标是杀锥虫活性的主要来源。然而，在针对 TcBDF2 的评估中，结果显示 9i 和 9t 是与 TcBDF2 结合能力最强的两种化合物，其解离常数（K_d）分别为 13.5 和 19.6?μM，这与杀锥虫活性更加一致。此外，9i 和 9t 不与 TcBDF3 结合，提示其在这些靶标之间具有选择性。分子对接和 200 ns 分子动力学模拟进一步支持嘌呤 9i 在 TcBDF2 溴结构域口袋中的稳定结合。此外，9i、9j、9m 和 9t 被预测具有适于药物口服给药的良好药代动力学特征。总体而言，三取代嘌呤表现出作为抗查加斯病先导化合物的前景，而 TcBDF2 的靶标结合与观察到的杀锥虫活性更为一致，从而为未来围绕效力、选择性和细胞毒性平衡开展优化提供了方向。

该论文发表于《Biomedicine》，围绕查加斯病新型候选药物的发现展开。查加斯病是一种由克氏锥虫（Trypanosoma cruzi）引起的被忽视热带病，全球患病人数众多，且随人口迁移已超出拉丁美洲流行范围。当前临床主要依赖苄硝唑（benznidazole，Bzn）和硝呋莫司（nifurtimox，Nfx）治疗，但这两种药物在急性期与慢性期中的疗效并不稳定，并常伴随较明显不良反应，限制了持续用药和总体疗效。因此，开发更安全、有效且具备新作用机制的抗克氏锥虫药物，具有明确而迫切的医学需求。

在此背景下，研究人员将嘌呤衍生物作为研究核心。嘌呤骨架（purine scaffold）在抗病毒、抗肿瘤和抗寄生虫药物研究中具有重要地位，既往亦有证据显示部分嘌呤类似物对锥虫类寄生虫具有低微摩尔甚至纳摩尔级活性。与此同时，cruzipain（TcCZP，寄生虫关键半胱氨酸蛋白酶）与 bromodomain factor 2（TcBDF2，表观遗传“读码器”蛋白）已被提出为潜在抗锥虫靶标。然而，已有化合物虽然在酶学或结合实验中表现良好，却不一定能转化为细胞层面的抗寄生虫效应，说明活性化合物、作用靶标与表型效应之间仍存在脱节。本研究因此试图系统回答两个问题：一是20种嘌呤衍生物是否对 T. cruzi 具有稳定的抗寄生虫活性；二是这种活性是否与 TcCZP 或 TcBDF2 等候选靶标相关。

研究人员首先构建并补充了20种嘌呤衍生物化合物库，其中18种为既往已合成化合物，9e 与 9t 为本研究新制备化合物。随后，研究人员从表型筛选入手，在两株墨西哥来源、具有代表性的 T. cruzi 血流锥鞭毛体株 NINOA 和 INC-5 中评价其离体杀锥虫活性。结果显示，这组化合物总体表现突出：对 NINOA 株，19/20 个化合物优于 Bzn，17/20 个优于 Nfx；对 INC-5 株，全部化合物均优于 Bzn，19/20 个优于 Nfx。尤其值得关注的是，9t 在两株虫体中均显示最低 LC₅₀，而 9e、9i、9j、9m、9n 也位列最活跃化合物之列。该结果提示三取代嘌呤可能是一类具有较强开发潜力的抗查加斯病先导结构。

方法概括：研究主要采用四类技术路径。其一，化学合成与结构表征，用于获得20种嘌呤衍生物并确认结构；其二，基于两株墨西哥 T. cruzi 血流锥鞭毛体和 Tulahuen-2 转基因无鞭毛体/VERO 细胞体系的表型活性与细胞毒性评价，其中 Tulahuen-2 株来源于 Frederick Buckner 提供的表达 β-半乳糖苷酶（LacZ）的转基因寄生虫；其三，采用 TcCZP 酶抑制实验与 TcBDF2/TcBDF3 热转移实验进行靶标层面验证；其四，结合分子对接、200 ns 分子动力学模拟以及 SwissADME 预测，对结合模式与药代性质进行分析。

在主体结果方面，论文首先给出了“3.1. Trypanocidal activity against T. cruzi trypomastigotes and structure-activity relationship”。这一部分说明，研究人员通过两株 T. cruzi 血流锥鞭毛体模型确认，大多数嘌呤衍生物的杀虫效力超过现有参比药物。进一步的构效关系（SAR）分析显示，取代基的类型与位置显著影响活性。对于 NINOA 株，“3.1.1. SAR for NINOA strain”指出，R₂ 或 R₃ 位引入三氟甲氧基（trifluoromethoxy）的 9e、9m、9n 活性增强，而在 R₂ 位引入苄基的 9t 活性最强；相反，双氯等多重卤代会削弱活性。对于 INC-5 株，“3.1.2. SAR for INC-5 strain”则显示类似趋势，9t 仍为最优，含三氟甲氧基或甲氧基取代的 9i、9j、9m、9n 普遍更强，说明电子效应与空间效应共同决定杀虫能力。文中还指出，C-2 位苯胺片段间位引入氟原子往往降低活性，这一趋势在两株虫体中较为一致。

接着，“3.2. Trypanocidal activity of selected purine derivatives against Tulahuen-2 T. cruzi amastigotes and cytotoxicity on Vero cells”进一步评估了最活跃的 6 个化合物在细胞内无鞭毛体阶段的效果及其对宿主细胞的毒性。该部分结果显示，除 9i 外，其余化合物均在低于 10 μM 的浓度下抑制 Tulahuen-2 无鞭毛体，其中 9m 的 IC₅₀ 为 1.89 μM，优于 Bzn 的 2.92 μM，为本研究在无鞭毛体模型中的最佳化合物。由于无鞭毛体是寄生虫在宿主细胞内复制并导致组织损伤的关键形态，因此这一结果具有较高临床相关性。与此同时，所有化合物在 Vero 细胞中均表现出一定细胞毒性，但 9m 和 9t 具有相对更高的 CC₅₀ 和更佳选择指数（SI），分别为 6.5 和 3.7。虽然尚未达到高通量筛选后续推进常用的 SI > 10 标准，但论文认为这些结果足以支持其作为 hit-to-lead（命中到先导）优化起点。

随后，“3.3. Identification of targets: in vitro activity against TcCZP and TcBDF2”聚焦作用机制探索。研究人员对活性较强的 6 个化合物进行了 TcCZP 抑制实验，结果发现其 IC₅₀ 均处于 87.1–404 μM 范围，明显高于细胞水平杀虫所需浓度，因此 TcCZP 难以解释主要表型活性。相对地，在 TcBDF2 热转移实验中，仅 9i 和 9t 产生了足够显著的熔解温度变化，并进一步测得 K_d 分别为 13.5 和 19.6 μM，与其杀锥虫活性处于更接近的量级。此外，这两种化合物在相同条件下不与 TcBDF3 结合，提示对 TcBDF2 具有一定选择性。该部分的核心结论是：TcBDF2 可能是部分活性嘌呤衍生物的重要作用靶标，而 TcCZP 并非本研究所见主要效应来源。另一方面，9m 虽然是表型筛选中最优命中物，但既不支持 TcCZP，也不支持 TcBDF2 为其主要靶标，提示其可能还存在其他未鉴定靶点。

在“3.4. Molecular docking studies”中，分子对接用于解释实验结果。针对 TcCZ，“3.4.1. Analysis for the interaction with T. cruzi cruzain (TcCZ)”显示 9j 可以占据与已知抑制剂相似的结合口袋，并与部分相同残基相互作用，但其 C-2 位较大取代基可能造成空间体积不利，从而导致酶抑制活性远弱于高效参考抑制剂。针对 TcBDF2，“3.4.2. Analysis for the interaction with TcBDF2”则表明 9i 与已知溴结构域抑制剂 BSP 在结合腔中具有相似姿势，嘌呤环出现明显重叠，且环丙甲基片段还可与 PHE31 形成额外有利相互作用，有助于复合物稳定。这一结果从结构层面支持 TcBDF2 作为 9i 作用靶标的合理性。

在“3.5. Molecular dynamics analysis on TcBDF2”中，研究人员采用 200 ns 分子动力学（MD）进一步验证 9i-TcBDF2 复合物稳定性。结果显示，结合 9i 后的 holo 蛋白均方根偏差（RMSD）低于 apo 蛋白，提示整体结构更稳定；同时，在结合位点相关的 33–48 位残基区域，holo 蛋白的均方根波动（RMSF）下降，说明配体结合降低了局部柔性。回转半径（RoG）变化不明显，表明 9i 的结合不会破坏 TcBDF2 的整体紧密性。综合来看，MD 结果与体外结合实验相互印证，支持 9i 稳定占据 TcBDF2 的疏水口袋。

最后，“3.6. Predicted physicochemical and ADME properties”从成药性角度评价了 9i、9j、9m 和 9t。SwissADME 预测显示，四者在氢键供体（HBD）、氢键受体（HBA）、cLogP、拓扑极性表面积（TPSA）及可旋转键数（NRB）等参数方面总体符合 Lipinski 和 Veber 规则，提示具备较好的膜通透性和口服吸收潜力。与此同时，文中指出其分子量接近经验阈值上限，并预测对 hERG 通道存在中等风险抑制作用，且可能为部分细胞色素 P450（CYP）底物。这说明该系列化合物在口服开发方面具有可取之处，但安全性和代谢性质仍需后续优化。

讨论部分的重点在于：本研究以多层次证据证明三取代嘌呤具有成为抗查加斯病先导化合物的潜力。其优势在于，对不同 T. cruzi 株系的感染型与复制型阶段均展现出微摩尔级活性，并且部分化合物已初步显示明确靶标线索。然而限制也十分清楚，即宿主细胞毒性导致 SI 偏低，这构成进一步开发的主要障碍。论文据此提出，未来应围绕降低细胞毒性、提升选择性以及明确额外分子靶标展开优化，特别是对 9m 与 9t 这类兼具表型活性和一定开发价值的化合物开展深入改造。

研究结论部分可概括为：研究人员评价了20种嘌呤衍生物对两株 T. cruzi 血流锥鞭毛体的体外活性，发现其总体杀锥虫效应多优于 Bzn 和 Nfx，其中 9t 对两株虫体均最强。对最有前景的6种嘌呤进一步测试后，4种在低于 10 μM 浓度下对无鞭毛体有效，9m 具有最低 IC₅₀ 并表现出相对更好的、尽管仍有限的 SI。初始设想中的 TcCZP 并非这些高活性化合物的有效靶标；相反，9i 与 9t 对 TcBDF2 的 K_d 分别为 13.5 和 19.6 μM，且不结合 TcBDF3，显示出一定靶标选择性。分子对接与分子动力学进一步表明，9i 可稳定结合于 TcBDF2 的疏水口袋。总体而言，嘌呤骨架可作为开发抗克氏锥虫溴结构域抑制剂的有前景策略，并为后续在效力、选择性与毒性之间寻求平衡的药物优化提供了依据。