《Biomedicine & Pharmacotherapy》：Exosomal MALAT1 expression associated with the cardioprotective effects of carvacrol in acute doxorubicin-induced cardiac injury: Potential involvement of Nrf2/Keap1-related signaling
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阿霉素（Doxorubicin, DOX）仍是许多化疗方案不可或缺的组成部分；然而，其临床应用受到剂量依赖性心脏毒性的限制，该毒性可能进展为扩张型心肌病和心力衰竭。在本研究中，研究人员探讨了植物化学物质香芹酚（carvacrol, CAR）对心脏功能、凋亡及N
阿霉素（Doxorubicin, DOX）仍是许多化疗方案不可或缺的组成部分；然而，其临床应用受到剂量依赖性心脏毒性的限制，该毒性可能进展为扩张型心肌病和心力衰竭。在本研究中，研究人员探讨了植物化学物质香芹酚（carvacrol, CAR）对心脏功能、凋亡及Nrf2/Keap1相关基因表达的影响，以及其与细胞外囊泡相关MALAT1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1）表达的关系。大鼠在接受单次20 mg/kg阿霉素注射诱导急性心脏损伤前，先口服香芹酚预处理两周。在阿霉素给药两天后评估心脏功能和心肌凋亡。H9c2心肌母细胞分别采用香芹酚（50、100和300 μM）与0.5 μM阿霉素的共处理或预处理方案。利用定量PCR（quantitative PCR, qPCR）检测Nrf2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2）、Keap1（Kelch-like ECH-associated protein 1）和细胞外囊泡相关MALAT1的表达水平。同时评估Caspase-3/7活性作为凋亡活性的指标。阿霉素处理损害了心脏功能，增加了心肌组织和H9c2细胞中的凋亡活性，上调了Keap1表达，并降低了Nrf2转录本水平。香芹酚处理降低了凋亡活性，改善了心脏功能参数，下调了Keap1表达，增加了Nrf2和细胞外囊泡相关MALAT1的表达，其中预处理方案显示出相对更强的保护作用。这些发现提示，香芹酚可能通过调节Nrf2/Keap1相关基因表达和改变细胞外囊泡相关MALAT1水平，减轻急性阿霉素诱导的心脏损伤。需要进一步的机制研究来阐明外泌体MALAT1在这些效应中的功能作用。
**论文解读：香芹酚通过调节Nrf2/Keap1信号及外泌体MALAT1表达减轻急性阿霉素心脏毒性**
**1. 研究背景与问题**
阿霉素（Doxorubicin, DOX）是一种广谱抗肿瘤蒽环类药物，自20世纪70年代以来一直是多种癌症化疗方案的基石。然而，其临床应用受到剂量依赖性心脏毒性的严重限制，该毒性可表现为氧化应激、心肌细胞凋亡和线粒体功能障碍，最终导致扩张型心肌病甚至心力衰竭。尽管已知DOX心脏毒性的机制涉及多个相互关联的细胞通路，但过量活性氧（reactive oxygen species, ROS）的产生以及包括核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2）信号在内的抗氧化防御系统受损被认为是主要贡献因素。Nrf2是细胞抗氧化防御的关键调节因子，通过激活抗氧化反应元件（antioxidant response element, ARE）依赖性基因转录来减轻氧化应激；Kelch样ECH相关蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein 1, Keap1）则在生理条件下促进Nrf2泛素化和降解。此外，长链非编码RNA转移相关肺腺癌转录本1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1, MALAT1）已被发现参与氧化应激相关信号通路，且间充质干细胞来源的富含MALAT1的细胞外囊泡在实验模型中显示出心脏保护作用。然而，天然酚类单萜化合物香芹酚（carvacrol, CAR）能否通过调节Nrf2/Keap1信号及外泌体MALAT1表达来减轻DOX心脏毒性尚不清楚。因此，该研究旨在体外和体内模型中探究香芹酚对DOX诱导心脏毒性的保护作用及其潜在分子机制。
**2. 研究目的与结论**
研究人员通过体内（雄性Wistar大鼠）和体外（H9c2心肌母细胞）实验，评估了香芹酚预处理对DOX急性心脏损伤后心脏功能、心肌凋亡、Nrf2/Keap1相关基因表达以及细胞外囊泡相关MALAT1表达的影响。结果表明，香芹酚预处理能显著改善DOX引起的左心室功能下降（左心室射血分数LVEF和缩短分数LVFS升高）、减轻心室扩张、降低心肌细胞凋亡率，并逆转DOX诱导的Nrf2下调与Keap1上调；同时，香芹酚处理增加了外泌体MALAT1的表达，且该变化与凋亡活性降低相关。这些发现提示香芹酚可能通过调控Nrf2/Keap1信号及外泌体MALAT1发挥心脏保护作用。该论文发表在《Biomedicine》期刊。
**3. 主要关键技术方法**
- **动物模型**：24只雄性Wistar大鼠（约250 g）购自洛雷斯坦医科大学，随机分为4组（n=6），包括对照组、香芹酚单独组（25 mg/kg/d灌胃14天）、DOX单独组（第14天腹腔注射20 mg/kg）及DOX+香芹酚组。第16天进行超声心动图检查后处死大鼠，取心脏组织进行TUNEL凋亡检测。
- **细胞模型**：H9c2心肌母细胞系购自伊朗巴斯德研究所，培养于含10%胎牛血清的DMEM中。细胞经不同浓度香芹酚（50、100、300 μM）预处理48 h后，更换培养基并加入0.5 μM DOX继续培养48 h。
- **mRNA表达分析**：使用qRT-PCR（SYBR Green法）检测细胞总RNA和细胞外囊泡RNA中Nrf2、Keap1及MALAT1的相对表达水平，以β-actin为内参，采用2
-ΔΔCt法计算。
- **凋亡检测**：使用Caspase-3/7活性试剂盒检测H9c2细胞中半胱天冬酶活性；采用TUNEL荧光染色（原位细胞死亡检测试剂盒）评估大鼠心肌组织凋亡细胞比例。
- **细胞外囊泡分离与表征**：收集细胞培养上清，通过PEG沉淀法（8% PEG 8000 + 0.5 M NaCl）分离细胞外囊泡，使用透射电子显微镜（TEM，Philips EM208s-100kv）观察形态并拍照。
**4. 研究结果**
**4.1 香芹酚预防阿霉素诱导的心肌细胞死亡且无内在毒性**
MTT实验显示，DOX对H9c2细胞具有强细胞毒性（IC
50：0.81 μM），而香芹酚在高达600 μM浓度下仍无毒性，表明其安全性较高。
**4.2 阿霉素引发急性心脏功能障碍和体内凋亡**
DOX注射后，大鼠左心室射血分数（LVEF）从72%降至57%（P < 0.0001），左心室缩短分数（LVFS）下降30%（P < 0.0001），左心室舒张末期内径（LVEDd）扩大15%（P < 0.0001），并出现代偿性心动过速（心率303 ± 9 vs. 265 ± 11 bpm，P < 0.01）。TUNEL染色显示凋亡心肌细胞增加8倍（6% vs. 48%，P < 0.001），H9c2细胞中Caspase-3/7活性升高2倍（P < 0.0001）。qPCR结果显示，DOX组Nrf2 mRNA表达降至对照组的20%（P < 0.0001），Keap1表达升高2.7倍（P < 0.0001），而外泌体MALAT1表达无明显变化。
**4.3 香芹酚恢复心脏功能并减轻凋亡**
香芹酚预处理使DOX诱导的凋亡率降低25%（48%降至36%，P < 0.001），LVEF从57%改善至64%（P < 0.0001），接近对照组的72%；LVFS从26%升至31%（P < 0.0001）；LVEDd从6.3 mm减至6 mm（P < 0.05）；心率从303 bpm降至270 bpm（P < 0.01）。体外实验中，300 μM香芹酚预处理将Caspase-3/7活性降至基线水平，且预处理方案效果优于共处理。
**4.4 香芹酚逆转Nrf2/Keap1失调**
DOX处理严重抑制Nrf2 mRNA（降至20%，P < 0.0001）并上调Keap1（2.7倍，P < 0.0001）。而香芹酚单独处理呈剂量依赖性轻度上调Nrf2并显著下调Keap1。香芹酚与DOX共处理或预处理均能显著提高Nrf2、降低Keap1表达，其中预处理组即使在50 μM浓度下也能抵抗DOX引起的初始失调。
**4.5 香芹酚处理与外泌体MALAT1表达增加相关**
PEG沉淀后TEM观察到50–150 nm的囊泡样颗粒。香芹酚处理显著增加H9c2细胞外泌体MALAT1表达，DOX处理则无变化；香芹酚与DOX共处理和预处理均上调MALAT1，其中预处理组上调更明显，但无剂量依赖性。比较相同香芹酚剂量（如300 μM）不同Nrf2/Keap1表达水平可见，更高外泌体MALAT1表达与更低Caspase-3/7活性相关。
**5. 讨论与结论**
讨论部分指出，DOX心脏毒性核心机制为氧化应激和凋亡失调，而Nrf2/Keap1通路是维持细胞氧化还原平衡的关键调节系统。本研究中香芹酚预处理能恢复Nrf2表达并下调Keap1，与既往增强Nrf2信号可减轻氧化损伤心脏损伤的报道一致。此外，香芹酚的心脏保护作用伴随外泌体MALAT1表达改变，提示MALAT1可能参与氧化应激反应和心肌细胞存活相关的调控网络（如与Keap1、Caspase-3或凋亡相关microRNAs相互作用）。但研究存在局限性：未建立外泌体MALAT1的因果作用、未进行蛋白质水平验证、细胞外囊泡表征不完整（缺少NTA和标志物验证）、仅使用急性高剂量DOX模型、未评估香芹酚对肿瘤化疗效果的影响，且体外实验仅用H9c2细胞系。未来需在慢性毒性模型、功能性敲除/过表达及肿瘤共培养模型中进一步验证。
**结论**：本研究证明，香芹酚能减轻急性阿霉素诱导的心脏损伤，该作用与调节Nrf2/Keap1相关基因表达及改变外泌体MALAT1表达相关。这些发现支持进一步探索天然化合物及细胞外囊泡相关lncRNAs在实验性心脏保护中的潜在作用。
