磁富集与级联放大技术用于超灵敏的PD-L1+外泌体表面等离子共振（SPR）分析

《Biosensors and Bioelectronics》：Magnetic Enrichment and Enabled Cascade Amplification for Ultrasensitive SPR Analysis of PD-L1+ Exosomes

　　

刘和珍|刘兆飞|Kwangnak Koh|陈红霞

上海大学生命科学学院，中国上海200444

摘要

由于外泌体在分子结构上与母细胞相似，因此它们可以作为早期癌症检测的稳定液体活检生物标志物。本文开发了一种基于Zr/Ce-MOF@Fe₃O₄核-卫星纳米复合体的磁富集辅助表面等离子体共振（SPR）检测方法，用于灵敏地分析外泌体。Zr/Ce-MOF以Zr作为金属节点，并掺杂了Ce，通过Ce³⁺/Ce⁴⁺氧化还原循环表现出内在的氧化酶活性。该材料无需外加H₂O₂即可催化3,3′,5,5′-四甲基联苯胺的氧化，生成高折射率沉淀物，从而显著增强SPR信号。Zr–O–P配位作用能够选择性地捕获外泌体上的磷脂膜，而Fe₃O₄卫星则有助于快速磁富集和分离。为了进一步提高特异性和抗污染性能，在传感器芯片上整合了预先用PD-L1靶向肽修饰的单壁碳纳米管层，从而能够选择性地识别磁富集的PD-L1⁺外泌体。纳米复合体的折射率增加与TMB沉积相结合，使得SPR响应得到增强。在优化条件下，该方法的检测限为2.16个颗粒/mL（信噪比=3），线性范围为10²–10⁷个颗粒/mL。整个分析过程仅需40分钟，并且该方法能够区分癌症患者和健康捐赠者的血清样本。这种方法为低丰度外泌体生物标志物的分析提供了一种实用策略。

引言

外泌体（Bai等人，2025年；Zhang等人，2025b年；Zhao等人，2026年）是几乎所有细胞类型主动分泌的30–150纳米的细胞外囊泡（Liu等人，2024a年；Wang等人，2024年）。它们携带蛋白质、脂质和核酸，在肿瘤进展、神经退行性和病毒感染等生理和病理过程中调节细胞间通讯（Mukerjee等人，2025年；Wang等人，2025b年）。由于外泌体在循环系统中的稳定性以及其成分与母细胞的相似性，它们正成为早期癌症检测（Ge等人，2025年；Zhang等人，2025a年）、治疗监测（Li等人，2026a年；Wang等人，2025a年）和微小残留疾病监测（Xu等人，2025年）的“液体活检”替代物。在外泌体负载物中，程序性死亡配体1（PD-L1）引起了广泛关注，因为它可以转移到受体免疫细胞上，从而系统性地抑制抗肿瘤T细胞反应（Shao等人，2025年；Zhu等人，2025年）。PD-L1存在可溶形式（sPD-L1）和囊泡锚定形式；然而，外泌体PD-L1具有高度的多价性，与MHC-I/II和四跨膜蛋白共定位，并且比sPD-L1具有更强的免疫抑制作用（Chen等人，2018a年；Wang等人，2025c年；Zhang等人，2026年）。因此，定量PD-L1⁺外泌体比测量总PD-L1更能准确反映肿瘤的免疫逃逸状态。尽管不同检测平台和分析条件下的PD-L1⁺外泌体浓度差异较大（Choi等人，2025年；Zhou等人，2023年），但它们在血液中的含量相对较低，仅占总细胞外囊泡的一小部分（Pang等人，2020年；Wang等人，2021年）。因此，它们的检测和定量仍然具有分析挑战性。

传统的外泌体检测方法，包括ELISA（Lee等人，2026年；Sharma等人，2025年）、Western blot（Hu等人，2024年；Liu等人，2025年）和单粒子干涉反射成像（Bortot等人，2024年），存在灵敏度低、处理时间长和样本量大的问题。基于磁珠的免疫捕获方法虽然通量较高，但依赖于昂贵的抗体，且存在批次间差异，还会掩盖抗原表位，无法捕获缺乏常见四跨膜蛋白（CD9、CD63、CD81）的PD-L1⁺外泌体亚群（Kaisar-Iluz等人，2022年；Karimi等人，2022年）。因此，迫切需要一种无需抗体的富集策略，以便与灵敏的检测平台无缝结合。最近的研究还开发了其他外泌体生物传感平台，例如基于便携式滚环扩增的适配体传感器（He等人，2024年）和用于电化学检测的可编程G-四链体@DNA纳米高速公路网络（Qiu等人，2026年）。表面等离子体共振（SPR）是这种转换平台的理想选择，它能够实时、无标记地监测生物分子相互作用，并对局部折射率变化高度敏感，特别适合检测传感器界面处的信号变化（Islam和Masson，2025年；Springer等人，2025年）。

磁性纳米材料，尤其是Fe₃O₄，具有快速磁分离和表面可调性的优点（Wei等人，2024年），但传统的Fe₃O₄@抗体结合物受到上述抗体缺点的限制。最近的研究证明了基于MOF的磁性纳米材料在外泌体富集和检测中的应用（Qin等人，2024a年；Qin等人，2024b年）。金属有机框架（MOFs）因其可调节的孔径、超大的表面积和多功能金属节点而具有吸引力（Patil等人，2025年）。Zr-MOFs（Li等人，2025年；Li等人，2026b年；Zheng等人，2025年）具有与外泌体磷脂上普遍存在的磷酸基团强烈的Zr–O–P配位作用，从而实现无需标记物的捕获（Cheng等人，2025年）。在相同的MOF晶格中引入Ce节点后，可以产生类似氧化酶的氧化还原活性位点，无需外加H₂O₂即可实现颗粒上的催化信号放大（Wu等人，2025年；Zha等人，2025年）。然而，将这两种互补功能整合到一个单一实体中，同时保持快速的磁操控并最小化非特异性污染，尚未实现。

本文报道了一种将三种单元操作合并到一个纳米卫星中的SPR检测方法（图1）：（1）通过Zr–O–P配位实现无抗体的PD-L1⁺外泌体富集，（2）利用Ce驱动的纳米酶催化TMB沉淀，（3）磁分离Fe₃O₄核心，留下高折射率的MOF/TMB双层结构。这种双重放大策略将检测限降低到2.16个颗粒/mL，并将总检测时间缩短至40分钟，比现有平台提高了一个数量级。这项工作不仅为外泌体PD-L1的定量提供了可靠的工具，还为低丰度囊泡生物标志物的超灵敏检测建立了一个通用框架。

章节片段

试剂和设备

试剂和设备的详细信息见支持信息中的S1.1。

Zr/Ce-MOF@Fe₃O₄纳米卫星的合成

Zr-MOF和Zr/Ce-MOF的合成方法参考了先前的报道（Chen等人，2024b年；Qian等人，2024年）。为了获得Zr/Ce-MOF@Fe₃O₄复合材料，采用了水热法（Chen等人，2024a年；Jia等人，2020年）。详细信息见支持信息中的S1.4。

传感器芯片修饰和SPR灵敏度提升

裸金芯片依次用去离子水、乙醇和去离子水冲洗，然后用氮气干燥，并用温和的piranha处理

单壁碳纳米管（SWCNTs）和金属有机框架（MOFs）的表征

通过扫描电子显微镜（SEM）结合能量分散X射线光谱（EDS）系统研究了SWCNTs、Zr-MOF、Zr-MOF@Fe₃O₄、Zr/Ce-MOF和Zr/Ce-MOF@Fe₃O₄的形态和元素分布。

如图1A和图S1所示，SWCNTs呈现出缠结的管状结构，分散性好且结构完整性高，证实了合成的成功，并为后续功能化提供了理想的基底。图1B显示

结论

通过结合无抗体的磁富集和纳米酶介导的催化沉积，建立了一种用于超灵敏检测PD-L1⁺外泌体的SPR生物传感策略。Zr–O–P配位作用使得可以直接与膜磷脂相互作用，从而实现无需标记物的外泌体捕获，而Fe₃O₄组分则有助于快速磁分离并减少背景干扰。此外，基于Ce的MOF还表现出氧化酶活性

CRediT作者贡献声明

Kwangnak Koh：可视化、监督、资源提供。Hezhen Liu：撰写初稿、实验研究、数据分析、概念构思。Hongxia Chen：撰写修订稿、可视化、监督、项目管理和资金申请。Zhaofei Liu：撰写初稿、方法设计、数据分析

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

本工作得到了国家自然科学基金（项目编号：62475143）和中国安徽省教育厅科研创新团队（编号：2023AH010072）的支持。