《Environmental Pollution》：In silico, in vitro, and in vivo profiling of endocrine activity and toxicity of selected oxygenated polycyclic aromatic compounds frequently encountered in PAH-contaminated soils
含氧多环芳香化合物（oxygenated polycyclic aromatic compounds，O-PACs）是广泛存在于环境中的污染物，但其毒理学谱系仍缺乏充分表征。研究采用整合的计算机模拟（in silico）、体外（in vitro）和体内（in vivo）研究策略，对11种结构多样的O-PACs进行了较为系统的内分泌活性、毒性及发育效应评估，其中包括1种芳香族含氧取代化合物和10种酮类（含羰基的O-PACs）。这三个方法学层级提供了互补但彼此不同的信息。计算机模拟结果预测，若干高环数O-PACs可与雌激素受体（ER）和雄激素受体（AR）发生相互作用，但不与糖皮质激素受体（GR）相互作用。与此一致，基于细胞的体外实验显示，少数化合物仅具有有限的ER活性，11种化合物中有8种表现出抗AR活性，而均未见GR活性。实验还进一步表明，这些化合物不具有雄激素样活性或遗传毒性，2种化合物显示出较弱的孕烷X受体（PXR）介导活性，6种O-PACs在暴露4 h后表现出芳香烃受体（AhR）介导活性。在这6种化合物中，3种O-PACs，即5,12-萘并四苯醌、11H-苯并[a]芴-11-酮和1,2-苯并蒽醌，在24 h后仍保持活性，其反应强度接近苯并[a]芘（B[a]P）。在体内实验中，这3种化合物在斑马鱼胚胎中诱导了急性毒性和发育缺陷，包括心包水肿和运动能力受损。借助转基因斑马鱼专门检测体系，这些化合物还在较低且无毒的浓度下诱导出显著的抗ER活性和AhR介导活性。总体而言，结果表明O-PACs能够诱发多样化的受体介导效应和发育效应，且部分衍生物的活性可与B[a]P相当甚至超过后者。机制层面反应与整体生物层面反应之间的一致性，凸显了这种多层级研究策略在完善危害表征中的价值，并支持对O-PAC污染物给予更多环境与监管关注的必要性。
该文发表于《Environmental Pollution》，围绕多环芳烃（PAHs）污染场地中常见但长期被忽视的含氧多环芳香化合物（oxygenated polycyclic aromatic compounds，O-PACs）展开系统毒理学评估。研究背景在于，O-PACs既可与母体PAHs来自相同污染源，也可在PAHs自然衰减、氧化或化学降解过程中形成，因而广泛存在于土壤、地下水和空气等环境介质中。与母体PAHs相比，这类化合物通常具有更高极性、更高水溶性以及更低辛醇-水分配系数，更易在饱和和非饱和土壤带中迁移，并可能形成更广泛的污染羽流。已有研究表明，在城市与工业污染土壤中，某些O-PACs的浓度甚至高于对应母体PAHs。然而，当前环境监管与风险评估仍主要聚焦16种优先控制PAHs，O-PACs尚未被充分纳入污染场地、土壤与地下水监测框架，由此可能低估其对人类健康和生态环境的风险。
现有研究多集中于O-PACs的细胞毒性和遗传毒性，而对其是否干扰激素信号、是否作用于核受体以及是否引发发育毒性的认识仍较有限。特别是，部分O-PACs可能像某些PAHs一样，作用于芳香烃受体（AhR，参与外源化合物代谢调控的重要配体激活转录因子）、雌激素受体（ER）和雄激素受体（AR），从而产生内分泌干扰效应。正是基于这一知识缺口，研究人员选取11种在PAHs工业污染场地土壤和地下水中具有代表性检出频率的O-PACs，采用计算机模拟、体外生物分析和体内斑马鱼胚胎模型相结合的多层级框架，评估其内分泌活性、遗传毒性以及发育毒性，并据此完善O-PACs的危害识别。
研究所用关键技术方法主要包括三类。第一，利用Endocrine Disruptome
?和Vega平台中的定量构效关系（QSAR）模型，对11种O-PACs与多种核受体的结合亲和力进行计算机模拟预测。第二，采用多种体外受体报告基因或功能检测体系，包括MELN、MDA-kb2、HG5LN-hPXR和HepG2细胞，分别检测ER、AR/GR、PXR与AhR相关活性，并结合γH2AX检测在HepG2和LS-174T代谢能力细胞中评价遗传毒性。第三，选择体外最活跃的3种化合物，在斑马鱼胚胎中开展鱼胚急性毒性试验（FET）、EASZY转基因抗/雌激素活性检测以及EROD活性检测，以评价发育毒性及体内ER、AhR信号干扰效应。
以下为论文主体结果的分项解读。
3.1. In silico endocrine activities of the 11 O-PACs
计算机模拟结果显示，11种O-PACs对糖皮质激素受体（GR）、肝X受体（LXR）、过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）、类视黄醇X受体（RXR）和甲状腺激素受体（TR）的预测亲和力总体为低或无。相较之下，多数高环数O-PACs对ER和AR显示中等至较高结合概率，且在不少情况下与其母体PAHs相近。以2-甲基蒽醌为代表的部分4环或5环O-PACs，对AR呈较高预测结合倾向；5,12-萘并四苯醌、11H-苯并[a]芴-11-酮、苯并[de]蒽-7-酮、1,2-苯并蒽醌和6H-苯并[cd]芘-6-酮则对ERβ呈较高预测结合概率，对ERα也有一定倾向。该结果表明，O-PACs的结构特征，尤其是芳环数增加，可能与其内分泌受体相互作用潜能相关。
3.2. In vitro profiling of the 11 O-PACs in receptor-based assays
体外受体生物分析揭示了各化合物在不同受体通路上的差异化活性谱。
3.2.1. ER-mediated activities
在ER介导活性方面，仅7-过萘并酮、5,12-萘并四苯醌、11H-苯并[a]芴-11-酮和1,2-苯并蒽醌表现出极弱雌激素样活性。其总体效力较低，但其中1,2-苯并蒽醌、5,12-萘并四苯醌和11H-苯并[a]芴-11-酮的活性高于参考PAH苯并[a]芘。研究同时指出，1,2-苯并蒽醌在高浓度下可能引发非受体依赖性的荧光素酶升高，因此其表观ER活性中可能存在部分非特异性信号。总体而言，受试O-PACs表现为弱或无ER激动效应，这与既往有限文献总体一致，但本研究补充了多种此前缺乏数据化合物的基础信息。
3.2.2. AR/GR-mediated activities
在AR和GR激动模式下，所有O-PACs均未显示雄激素样或糖皮质激素样活性，这与B[a]P的表现一致。然而，在AR拮抗模式下，11种化合物中有8种表现出不同程度的抗AR效应，仅二苯并呋喃、CP[def]PheO和B[cd]PyrO不活跃。平行MTT检测表明，这些抑制效应并非由细胞毒性引起。苯并[de]蒽-7-酮是最强的抗AR化合物，效力约为氟他胺（Flut）的0.39倍，并约为B[a]P的2倍；7-过萘并酮、9,10-蒽醌、5,12-萘并四苯醌和11H-苯并[a]芴-11-酮表现中等抗AR活性；2-甲基蒽醌、1,2-苯并蒽醌和9-芴酮活性较弱。该部分结果说明，O-PACs虽不表现AR激动效应，但其中相当一部分具有AR拮抗潜力。
3.2.3. PXR-mediated activities
在孕烷X受体（PXR）通路上，仅7-过萘并酮和2-甲基蒽醌被确认具有真实的弱PXR激动活性。其余显示剂量反应趋势的化合物在亲本HG5LN细胞中也呈现类似变化，因此更可能属于非特异性荧光素酶增强，而非真正的PXR介导反应。整体来看，PXR并非这些O-PACs的主要分子靶点。
3.2.4. PAH- and dioxin-like AhR activities
AhR相关活性是本研究最突出的机制性发现之一。暴露4 h后，9,10-蒽醌、2-甲基蒽醌、5,12-萘并四苯醌、CP[def]PheO、11H-苯并[a]芴-11-酮和1,2-苯并蒽醌可在HepG2细胞中诱导EROD活性，提示存在PAH样AhR激动效应。其中5,12-萘并四苯醌效力最高，约为B[a]P的94倍；1,2-苯并蒽醌略低于B[a]P；11H-苯并[a]芴-11-酮几乎与B[a]P相当；CP[def]PheO、2-甲基蒽醌和9,10-蒽醌则弱得多。暴露24 h后，仅5,12-萘并四苯醌、11H-苯并[a]芴-11-酮和1,2-苯并蒽醌仍保持AhR活性，其余化合物消失，说明这3种化合物兼具更持久的二噁英样AhR反应特征。研究据此确定这3种化合物为后续体内评价的重点对象。
3.3. Genotoxicity
在遗传毒性方面，11种O-PACs在HepG2与LS-174T两种具有代谢能力的细胞中，经24 h暴露后均未在γH2AX检测中诱导遗传毒性或明显细胞毒性。研究同时对照文献指出，某些O-PACs曾在更高浓度或更长暴露时间下表现微核形成、突变性或其他基因毒性效应，因此本研究结论应限定于当前实验条件，即相对较低浓度与24 h短期暴露条件下未观察到遗传毒性。
3.4. In vivo effects of B[a]FluO, 1,2-BAntQ, and 5,12-NCQ on zebrafish embryos
研究进一步选取11H-苯并[a]芴-11-酮、1,2-苯并蒽醌和5,12-萘并四苯醌，在斑马鱼胚胎中评价其体内毒性和信号通路效应。
3.4.1. Toxicity and morphological effects
鱼胚急性毒性试验显示，11H-苯并[a]芴-11-酮和1,2-苯并蒽醌毒性最高，96 hpf时LC
50分别为1.98 μM和0.91 μM；5,12-萘并四苯醌在所测浓度范围内未获得LC
50，但在所有浓度下均可降低自发运动。形态学上，11H-苯并[a]芴-11-酮和1,2-苯并蒽醌均引起显著心包水肿，其中前者自24 hpf起即出现高发生率早发性心包水肿，后者则在0.37 μM即可使全部胚胎发生心包水肿，并伴发围卵黄囊水肿和迟缓表现。这些结果表明，活性最强的O-PACs同时具有明显发育毒性，特别是潜在心脏毒性。
3.4.2. (Anti-)estrogenic activities
在EASZY转基因斑马鱼模型中，3种化合物均未诱导GFP表达，说明其在体内并不激活胚胎脑内ER依赖性的cyp19a1b表达。相反，三者均可降低基础GFP强度，其中5,12-萘并四苯醌和1,2-苯并蒽醌抑制具有统计学意义。在与10 nM E
2共暴露时，3种化合物均强烈抑制E
2诱导的GFP表达，而且这一现象出现在不引起发育毒性和不改变基础GFP的浓度下，提示其主要表现为体内抗ER干扰作用，而并非对放射状胶质细胞的直接毒性。该结果与体外弱ER激动活性形成对照，提示完整生物体中的AhR-ER通路串扰可能改变其内分泌效应方向。
3.4.3. In vivo EROD activities
体内EROD检测进一步证实，3种化合物均可在斑马鱼胚胎中浓度依赖性诱导AhR通路。1,2-苯并蒽醌是最强体内AhR激动剂，EC
50为0.06 μM，最大诱导强度达到TCDD的128%；5,12-萘并四苯醌和11H-苯并[a]芴-11-酮也可有效诱导EROD，但所需浓度更高。尤其值得注意的是，1,2-苯并蒽醌在体内AhR活性最强，同时也对应最严重的发育毒性表型，强化了AhR信号通路参与其发育性尤其是心脏毒性的证据。
3.5. Integrating in silico, in vitro, and in vivo observations
论文最后对三类研究层级进行了整合。总体而言，计算机模拟、体外实验和体内实验提供了较为一致而互补的毒理学证据。计算机模拟能够较好识别ER和AR潜在相互作用，尤其对高活性ER相关化合物具有一定预测价值；体外实验可进一步揭示具体受体激动或拮抗模式，并筛出AhR活性最突出的化合物；体内实验则验证了这些机制信号在完整生物系统中的现实相关性，并揭示了发育毒性与通路串扰等仅依赖体外方法难以充分捕捉的现象。11H-苯并[a]芴-11-酮、5,12-萘并四苯醌和1,2-苯并蒽醌是三层证据中最一致、最值得关注的高危O-PACs，尤其1,2-苯并蒽醌在机制活性与整体毒性上均最突出。
讨论部分的核心在于，O-PACs并非仅是PAHs的转化副产物或环境伴生物，而是具有独立毒理学意义的一类污染物。研究显示，尽管其遗传毒性在本实验条件下不显著，但它们可通过ER、AR、PXR和尤其AhR等多条受体通路产生内分泌和发育效应。不同方法层级之间并非简单重复，而是分别反映结构预警、细胞机制和整体生物学后果。体外ER弱激动与体内抗ER效应之间的差异，也强调了代谢过程、毒代动力学以及受体串扰在真实生物系统中的重要性。因此，对于O-PACs危害识别，仅依赖单一方法或仅关注母体PAHs都可能不足。
研究结论部分可译为：本研究采用整合的计算机模拟（in silico）、体外（in vitro）和体内（in vivo）框架，对11种结构多样的含氧多环芳香烃（O-PACs）的ER、AR、GR、抗AR、PXR和AhR介导活性，以及遗传毒性、毒性和发育效应进行了系统危害评估。本研究通过确认若干研究不足O-PACs的活性或无活性状态，扩展了相关数据集，为未来毒理学评估提供了新的基础信息。总体而言，该整合策略揭示O-PACs具有广泛的受体介导效应和发育效应，其中部分衍生物在特定通路中的活性可与B[a]P相当甚至超过B[a]P。上述发现强调，应将O-PACs纳入监管监测与风险评估框架，而非仅关注母体PAHs和B[a]P。此外，本研究凸显了多层级评价对于准确表征新兴PAH衍生物危害的重要价值，因为任何单一方法学层级都无法独立获得如此完整的认识。
