短短芽孢杆菌（Brevibacillus fluminis）SLAM AEPS10 对培养肉废培养基的生物转化将污染修复与聚（3-羟基丁酸）（PHB）生产相耦联

《Environmental Technology & Innovation》：Bioconversion of cultivated-meat spent medium by Brevibacillus fluminis SLAM AEPS10 links remediation with poly(3-hydroxybutyrate) production

　　

培养肉废培养基（cultivated-meat spent medium，CSM）是一类新兴的哺乳动物细胞培养废物流，其中含有残余有机碳、铵、乳酸、蛋白质及代谢产物。为降低 CSM 管理的环境负担，亟需将污染物去除与资源回收相结合的处理策略。本研究旨在鉴定一种能够将 CSM 修复与聚（3-羟基丁酸）（poly(3-hydroxybutyrate)，PHB）生产相耦联的细菌。研究人员对 29 株来源于瘤胃的分离菌进行筛选，依据其在 CSM 中的生长能力、聚合物回收表现及甲基 3-羟基丁酸（methyl 3-hydroxybutyrate）检出结果，确定短短芽孢杆菌（Brevibacillus fluminis）SLAM AEPS10 为目标菌株。在 CSM 中培养 72 h 期间，AEPS10 保持了 86.71% 的存活率，并使生化需氧量（biochemical oxygen demand，BOD）、总有机碳（total organic carbon，TOC）和铵分别降低 77.8%、62.7% 和 46.5%。经傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy，FT-IR）和核磁共振波谱（nuclear magnetic resonance，NMR）分析，回收聚合物被鉴定为 PHB 均聚物。AEPS10 产生了 15.83 mg/L 的 PHB，且平均每个细胞积累 6.51 个胞内颗粒，证实其在 CSM 培养过程中发生了细胞内 PHB 储存。与一株能够在 CSM 中生长但不产生 PHB 的菌株相比，AEPS10 特异性携带 phaC 和 phaQ，且其位于按 fabG、phaC、phaQ 和 fabG 顺序排列的基因簇中，这与Ⅳ类聚羟基脂肪酸酯（polyhydroxyalkanoate，PHA）合酶系统相一致。上述结果确立了 AEPS10 介导的 CSM 转化是一种将污染修复与胞内 PHB 回收相连接的单菌过程。

该论文发表于《Environmental Technology》，聚焦培养肉产业中新兴废物流——培养肉废培养基（CSM）的资源化处置问题。研究背景在于，培养肉生产依赖大规模哺乳动物细胞培养，培养结束后产生大量含有残余有机碳、乳酸、铵、蛋白质以及细胞来源代谢物的废培养基。这类废液既具有较高有机污染负荷，也具有显著含氮负荷，因此下游处理复杂，若仅以传统废水治理思路处理，不仅难以充分回收其中残留资源，也会增加培养肉产业的环境足迹。现有关于 CSM 的研究主要集中于污染物去除、培养基再生和部分回用，而针对其直接转化为高附加值生物材料的研究仍较少。与此同时，以农业残渣、食品废弃物或污泥等废弃底物生产聚羟基脂肪酸酯（PHA）的研究已经证明，废弃碳源可被微生物转化为可生物降解聚酯材料。然而，CSM 作为哺乳动物细胞培养废物流，与传统有机废弃物在成分和应用场景上均不相同，其与聚（3-羟基丁酸）（PHB）回收之间仍存在明显研究空白。因此，开展本研究的必要性在于寻找既能耐受 CSM 复杂组成、又能同步削减污染负荷并合成储存型聚合物的功能菌株，从而建立废物流治理与材料回收耦合的新路径。

围绕这一目标，研究人员从瘤胃来源细菌中开展筛选，因为瘤胃微生物通常具有适应复杂混合底物的代谢多样性。经过初筛和复筛后，研究人员锁定短短芽孢杆菌 B. fluminis SLAM AEPS10，并系统评估其在 CSM 中的生长存活、污染负荷去除、PHB 合成与回收能力，以及相关基因组学基础。最终得出的核心结论是：AEPS10 能够在 CSM 中保持较高活性，同时显著降低生化需氧量（BOD）、总有机碳（TOC）和铵浓度，并在细胞内积累可回收的 PHB；回收产物经化学结构表征确认为 PHB 均聚物；基因组分析显示，该菌株具有与Ⅳ类 PHA 合酶系统一致的 PHB 生物合成位点。该研究的重要意义在于，首次将培养肉废培养基的污染治理与 PHB 回收明确整合为单一细菌过程，为细胞农业废物流的高值化利用提供了概念验证，也为未来构建更低环境负担的培养肉生产体系提供了基础。

在技术方法方面，研究人员首先以来源于荷斯坦牛瘤胃液的 29 株分离菌作为筛选对象，在 CSM 固体和平板体系中评价其生长能力，并结合 Sudan Black B 染色、Nile Red 染色、小规模二甲基碳酸酯（dimethyl carbonate，DMC）提取及酸性甲醇解后气相色谱-氢火焰离子化检测（GC-FID）筛选 PHB 候选菌株。随后在 72 h CSM 培养体系中，通过 LIVE/DEAD 染色评估细胞活性，测定 BOD、TOC、NH₄⁺-N、总氮（TN）及 C/N 比，结合 DMC 提取、傅里叶变换红外光谱（FT-IR）、扫描电子显微镜（SEM）、热重/导数热重分析（TGA/DTG）以及 ¹H、¹³C 核磁共振（NMR）鉴定回收聚合物；再利用单细胞荧光成像定量胞内颗粒，最后通过 Oxford Nanopore 测序、平均核苷酸一致性（ANI）比较及功能注释解析 PHB 合成相关基因簇。

在研究结果部分，论文按照多个小节逐步建立了 AEPS10 具备 CSM 生物转化和 PHB 回收能力的证据链。

3.1. Isolation and identification of CSM-metabolizing strains
研究人员首先从 29 株瘤胃来源菌株中筛查能够利用 CSM 的菌株，优先关注与已知 PHA 产生菌在系统发育上接近的属。通过 CSM 琼脂平板菌落形成能力评价，共有 6 株菌能够形成可见菌落，分别隶属于 Paenibacillus 和 Brevibacillus 等类群。进一步在液体 CSM 中绘制生长曲线发现，除 AEPET1 外，其余菌株的 OD₆₀₀ 均可超过 1.0，说明 CSM 可支持其生长。其中，AEPS10 虽生长速度不是最快，但能够稳定进入稳定期并维持至 72 h。随后基于 16S rRNA 基因序列构建系统发育树，结果表明 AEPS10 在 Brevibacillus 类群中形成相对独立的分支，提示其与其他分离株存在明显遗传差异。该部分结果说明，瘤胃微生物中存在可适应 CSM 的候选菌株，而 AEPS10 兼具可培养性和明确分类地位，适合进入后续功能筛选。

3.2. Screening of biopolymer accumulation
在确认菌株可利用 CSM 后，研究人员进一步筛查其胞内聚合物积累能力。Sudan Black B 染色显示，6 株分离菌均存在不同程度的胞内脂质样包涵体，但这一方法对 PHB 的选择性有限。进一步采用 Nile Red 染色后，仅 AEPS2、AEPS9 和 AEPS10 表现出明确荧光信号。值得注意的是，AEPS2 的荧光主要与芽孢化细胞相关，AEPS9 的荧光区较小且分布不规则，并且在液体 CSM 中后期生长下降；相比之下，AEPS10 出现了形态圆整、与阳性对照 Cupriavidus necator N?1 相似的胞内颗粒。随后使用统一条件进行 DMC 小规模提取并结合酸性甲醇解后的 GC-FID 分析，仅 AEPS10 获得了清晰可见的白色回收物，并检测到来源于 PHB 的 3HBME 峰，估算其 PHB 含量为 7.4 ± 1.1% 干细胞重（DCW）。这一结果使 AEPS10 成为唯一同时满足 CSM 生长、聚合物可回收和 PHB 特征产物可检出的目标菌株。

3.3. Viability and remediation performance of B. fluminis AEPS10 and C. necator N?1 in CSM
为了评价 AEPS10 在 CSM 中的生长稳定性及修复效能，研究人员将其与经典 PHB 产生菌 C. necator N?1 进行比较。在培养初始时，两菌株均具有较高活率；72 h 后，AEPS10 仍保持 86.71% 的存活率，而 N?1 降至 16.83%，并在显微观察中表现为大量红染碎片，提示细胞膜严重受损。污染负荷方面，两菌株均可降低 CSM 的有机负荷，但 AEPS10 表现更均衡：BOD 从 3.00 g/L 降至 0.67 g/L，下降 77.8%；TOC 从 3.35 g/L 降至 1.25 g/L，下降 62.69%；同时将铵浓度从 5.35 mmol/L 降至 2.86 mmol/L，下降 46.5%。相反，N?1 虽然降低了 BOD 和 TOC，却使铵浓度升高至 11.30 mmol/L，这与显著细胞裂解导致胞内含氮组分释放相一致。该部分结果表明，AEPS10 不仅能在 CSM 复杂胁迫条件下维持较高存活，而且能够同步削减有机碳和无机氮负荷，体现出更适合用于 CSM 修复的生理特征。

3.4. PHB extraction and characterization
在确定 AEPS10 可有效修复 CSM 后，研究人员对其回收聚合物进行了系统理化鉴定。基于生长动力学和时间序列 Nile Red 观察，72 h 被选定为最佳提取时间点。FT-IR 结果显示，AEPS10 提取物在 1721–1723 cm^?1 处具有强烈的酯羰基伸缩振动峰，这是 PHA 型聚酯的典型特征；同时 900–1300 cm^?1 区间还存在与 C-O-C 伸缩和 C-H 弯曲相关的吸收带。AEPS10 提取物与商品 PHB 的光谱相似性极高，Pearson 相关系数达到 0.9869 ± 0.003。SEM 观察发现，AEPS10 回收颗粒呈较均一、较细小的球形，平均直径 0.40 ± 0.04 μm，小于 N?1 和商品 PHB 对照，表明其沉淀行为较为均一。热重分析显示，该聚合物具有单一主降解事件，DTG 峰值位于 279.59 °C，总失重达 97.49%，符合 PHB 类聚酯的热降解特征。更为关键的是，¹H NMR 和 ¹³C NMR 仅检测到 3-羟基丁酸重复单元对应的特征信号，未发现羟基戊酸等其他单体的共聚证据，因此最终确认 AEPS10 回收产物为 PHB 均聚物。该部分从光谱学、形貌学和热学多个层面证明，AEPS10 在 CSM 中合成并积累的确实是可回收的 PHB。

3.5. Cellular PHB accumulation and PHB production
在单细胞水平，研究人员通过 Nile Red 成像量化了 AEPS10 的胞内 PHB 颗粒特征。结果显示，AEPS10 平均每个细胞含 6.51 ± 4.50 个颗粒，高于 N?1 的 3.31 ± 1.72 个；两者单个颗粒面积相近，但 AEPS10 的每细胞总颗粒面积更大。由此可见，AEPS10 的 PHB 积累优势主要来自颗粒数量增加，而不是单颗粒显著增大。在产量方面，AEPS10 的干细胞量和 PHB 浓度均高于 N?1，分别达到 73.33 ± 12.83 mg/L 和 15.83 ± 1.44 mg/L。虽然这一 PHB 水平低于某些富碳废弃底物体系，但研究人员指出，这可能与 CSM 体系中的碳源限制有关。为验证这一点，研究人员补加葡萄糖进行培养，发现当葡萄糖浓度为 5 g/L 时，PHB 浓度提升至 80 ± 10 mg/L，对应计算 C/N 比为 9.10 mol C/mol N。该结果说明，AEPS10 在原始 CSM 中确实受到碳可利用性限制，但其 PHB 合成能力可通过补充碳源显著增强，从而进一步支持其作为“修复—回收”耦合菌株的应用潜力。

3.6. Genome features and PHB biosynthesis genes
为解释 AEPS10 与另一株可在 CSM 生长但不产生 PHB 的 AEPS2 之间的差异，研究人员开展了比较基因组分析。结果显示，两菌株基因组大小分别约为 5.55 Mb 和 5.89 Mb，平均核苷酸一致性（ANI）仅为 70.80%，提示它们在基因组层面具有显著差异。AEPS10 与 B. fluminis JCM 15716^T 的 ANI 为 92.47%，支持其分类归属。功能分类比较发现，AEPS10 在脂肪酸、脂质和类异戊二烯代谢相关功能上富集程度更高，这与 PHB 前体供给及储存型聚酯形成相关。进一步分析与 CSM 修复和 PHB 合成相关的关键基因发现，两菌株均含有 phaA、amtB 和 glnA，意味着其都具备一定的乙酰辅酶 A（acetyl-CoA）转化和铵同化能力；然而，只有 AEPS10 携带负责 PHB 聚合的 phaC 以及转录调控因子 phaQ，这为其产生 PHB 提供了直接遗传学基础。更深入的分析表明，AEPS10 的 PhaC 分子量为 39.1 kDa，更符合Ⅲ类或Ⅳ类二聚体 PHA 合酶范围，而序列相似性更接近Ⅳ类系统。其 PHB 合成位点由 phaC、phaQ 和两个 fabG 同向排列构成，顺序为 fabG、phaC、phaQ、fabG。与典型Ⅳ类系统中 phaB 紧邻 phaC 的结构不同，AEPS10 在该位置上出现了注释为 fabG 的基因。序列比较显示，fabG(1) 与参考菌株 PhaB 蛋白相似性最高，因此被认为是最可能承担 PhaB 样还原酶功能的候选基因。此外，研究人员在 phaC 邻近区域未发现典型 phaR，但识别出一个位置上相符、与 PhaR 具有低水平相似性的假定蛋白 ACTID9_03820，认为其可能是一个分化较大的 PhaR 样辅助亚基候选。总体上，该部分结果从基因组层面解释了 AEPS10 能在 CSM 中合成 PHB 的原因，并提示其可能具有不同于典型模式菌的Ⅳ类样 PHB 生物合成体系。

在讨论层面，论文将 AEPS10 的价值概括为一种可在单一细菌过程中实现 CSM 污染削减与胞内 PHB 回收的功能菌株。研究证据覆盖过程层面、材料层面、细胞层面和基因组层面：过程层面表现为 BOD、TOC 和铵显著下降，说明其具备实际修复潜力；材料层面通过 FT-IR、NMR、SEM 和热分析确认回收物为 PHB 均聚物；细胞层面通过 Nile Red 成像证实胞内颗粒积累；基因组层面则揭示出与Ⅳ类 PHA 合酶系统一致但具有独特基因排列方式的 PHB 合成位点。论文同时指出，AEPS10 的 PHB 积累受到培养阶段和碳源可利用性影响，因此未来仍需在氧传递、pH 控制和培养形式等条件上进行优化，并进一步解析 CSM 中碳氮流向以及验证候选辅助亚基的功能。但这些内容在文中被明确作为后续工作方向，而非既定结论。

研究结论部分可译为：本研究鉴定出短短芽孢杆菌 B. fluminis SLAM AEPS10 为一种能够在 CSM 中生长并产生可回收 PHB 的细菌。通过对瘤胃分离菌的筛选，基于其在 CSM 中的生长、聚合物回收以及酸性甲醇解后 3HBME 的检出，确定 AEPS10 为目标菌株。在 CSM 中，AEPS10 保持较高存活率，并降低了 BOD、TOC 和铵含量。回收聚合物经 FT-IR 和 NMR 证实为 PHB 均聚物，Nile Red 成像验证了胞内 PHB 颗粒积累。这些发现表明，AEPS10 能够在单一细菌过程中实现 CSM 处理与 PHB 回收的耦合。时间尺度上的颗粒变化模式及葡萄糖补加响应提示，AEPS10 的 PHB 积累受培养阶段和碳可利用性影响。未来工作需界定能够在保持碳氮负荷削减的同时增强 PHB 积累的培养条件，包括氧传递、pH 控制和培养形式；还需开展碳氮去向分析，以量化 CSM 组分向生物量、PHB 和残余培养基组分的转化；同时，应验证这一Ⅳ类样 PHB 生物合成位点及其辅助亚基候选，从而明确 AEPS10 中 PHB 形成的调控基础。结合更大规模培养和生命周期评价（life cycle assessment，LCA），这些分析将有助于更完整地评估 AEPS10 介导的 CSM 转化作为废物处理与 PHB 回收一体化路线的应用价值。