Luminal B样乳腺癌原发与复发灶的基因组及转录组学评估

《ESMO Open》：Genomic and transcriptomic evaluation of primary and recurrent luminal B-like breast cancer

　　

背景：Luminal B样乳腺癌（LBBC）约占乳腺癌的40%，较Luminal A样疾病复发风险更高、预后更差。本研究旨在探讨LBBC原发灶与复发灶之间的分子改变，阐明LBBC复发的驱动因素并识别潜在治疗靶点。 材料与方法：研究人员对15例LBBC患者（49份样本：15例原发灶、21例复发灶及15例血液样本；其中6例各含2个复发灶）采用覆盖769个癌症相关基因的定制Panel进行DNA测序，并行RNA测序（RNA-seq）。其中13例有配对的DNA测序数据，5例有配对的RNA-seq数据（3例同时具备DNA数据）。将复发灶的分子特征与原发灶进行比较，聚焦基因突变、拷贝数变异、肿瘤异质性、基因表达、通路及免疫细胞组成，进一步识别与LBBC复发相关的分子特征。 结果：大多数基因突变与拷贝数变异主要建立于原发灶并在复发中持续存在。TP53与PIK3CA在原发与复发灶中均为最高频改变基因，而EGFR与GNAS突变在复发灶中出现。复发灶上调的通路包括细胞周期检查点、DNA复制及抗原加工-交叉呈递。相较于原发灶，复发灶肿瘤微环境中T细胞丰度增加。此外，探索性未校正分析显示，原发灶较高的突变等位基因肿瘤异质性（MATH）评分与更差的复发无进展生存（RFS）相关（P= 0.032）。 结论：本研究揭示了LBBC复发的基因组与转录组演化，提示多数驱动事件在原发灶即已确立。获得性突变或改变可作为潜在治疗靶点进一步研究，MATH评分可能是与LBBC复发相关的候选生物标志物。

论文解读：Luminal B样乳腺癌原发与复发灶的基因组及转录组学评估

研究背景

乳腺癌是全球最常见的女性恶性肿瘤。尽管筛查与治疗进步使早期患者得以治愈性切除，但高级别乳腺癌因高复发率导致生存仍不乐观。激素受体（HR）阳性乳腺癌是最常见的复发亚型。Luminal乳腺癌定义为HR阳性，基于人表皮生长因子受体2（HER2）与Ki67免疫组化（IHC）可分为Luminal A样与Luminal B样（LBBC）两个替代亚型，近似于转录组定义的Luminal A与Luminal B内在亚型。Luminal A样为HER2阴性且Ki67<14%，其余归为LBBC。LBBC占所有乳腺癌约40%，表现为肿瘤体积大、淋巴结转移率高、组织学分化差、对内分治疗相对不敏感，因而比Luminal A样复发风险更高、预后更差。虽然临床常加用辅助治疗以降低术后复发，但能可靠预测LBBC高复发风险的遗传生物标志物仍缺乏。临床前模型与患者队列研究显示，肿瘤复发过程伴随显著分子与细胞改变，包括原发与转移灶间HR/HER2状态的不一致。高通量测序发现，多数原发驱动突变在复发中保留，但部分基因（如ESR1、MYLK、PEAK1、SLC2A4RG、EVC2）在转移性乳腺癌中更易突变。不同亚型演变各异，三阴性乳腺癌（TNBC）复发灶可见突变与转录组偏移及免疫激活基因下调。然而，LBBC配对原发与复发灶的基因组及转录组比较仍有限。为填补此空白，研究人员对LBBC患者配对原发与复发肿瘤进行多组学表征，整合组学与以复发无进展生存（RFS）为终点的临床特征，以阐明LBBC复发与耐药的潜在驱动机制。本文发表于《ESMO Open》。

主要关键技术方法概括

研究人员纳入15例经IHC确诊的LBBC患者，收集配对原发与复发/转移灶的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织及外周血对照。共36例FFPE肿瘤样本（15例原发，21例复发/转移，其中6例各贡献2个复发灶）及15例外周血。对13例原发与18例复发肿瘤行覆盖769个癌症相关基因的靶向DNA测序；对5例患者的5例原发与7例复发肿瘤行RNA测序（RNA-seq），其中3例同时具DNA数据。利用配对外周血过滤种系突变，通过VarDict/FreeBayes识别体细胞变异，ctCNV对拷贝数变异（CNV）进行配对分析。计算肿瘤突变负荷（TMB）、突变等位基因肿瘤异质性（MATH）及拷贝数不稳定性（CNI）评分。转录组通过fastp、Bowtie2、STAR比对与FeatureCounts定量，DESeq2识别差异表达基因（DEGs），ClusterProfiler做KEGG富集，GSEA评估通路方向，CIBERSORT与单样本GSEA（ssGSEA）估算肿瘤微环境免疫细胞组成。生存分析采用Kaplan–Meier与log-rank检验。

研究结果

Clinical characteristics of LBBC patients（LBBC患者临床特征）

15例LBBC患者中位诊断年龄43岁（26–69岁），5例接受新辅助化疗，中位RFS为30个月（12–62个月）。多数患者（13/15）接受蒽环类和/或紫杉类化疗，10例接受他莫昔芬或芳香化酶抑制剂内分泌治疗，9例接受放疗，4例HER2阳性者接受曲妥珠单抗靶向治疗。15例原发与21例复发灶中，复发多为局部区域（淋巴结、胸壁、胸骨、同侧乳腺），2例为远处（肝、骨）。所有原发灶ER阳性，86.7% PR阳性，26.7% HER2阳性；复发灶中65.0%保留ER/PR阳性，20.0% HER2阳性，26.7%（4/15）对原发-复发配对显示ER/PR不一致（原发阳性、复发阴性）。

Genomic landscape of LBBC from primary to recurrent disease（LBBC从原发到复发的基因组景观）

对13例原发与18例复发肿瘤靶向测序显示，驱动基因大多共享。TP53在原发与复发中突变率分别为46.2%（6/13）与44.4%（8/18），PIK3CA为38.5%（5/13）与38.9%（7/18）。SPEN突变在原发中稍多（23.1%对11.1%），KMT2C、TSC1、WHSC1L1改变在复发中略多。EGFR与GNAS突变仅在复发灶检出（3/18对0/13），未达显著性。热点分析显示PIK3CAp.H1047R（3/13）与p.E545K（3/18）是中国LBBC最常见单核苷酸变异。配对分析示PIK3CA突变状态一致率83.3%，TP53为100%。拷贝数变异高度一致，MCL1与MYC扩增最常见。ABCB1、IRF4、NKX2-1缺失仅见于原发，FGF3/FGF4缺失及ICOSLG、U2AF1、ARID5B、PIK3R3扩增仅在复发中出现。

The association between tumor genetic heterogeneity and clinical outcome（肿瘤遗传异质性与临床结局的关联）

基于DNA测序计算TMB、CNI与MATH，原发与复发灶间三者均无显著差异（Wilcoxon符号秩检验）。探索性未校正Kaplan–Meier分析显示，原发灶高MATH评分与较短RFS相关（P=0.032），而TMB与CNI未显出显著关联。

Transcriptomic and immune landscape of LBBC from primary to recurrent disease（LBBC从原发到复发的转录组与免疫景观）

对5例原发与7例复发肿瘤行RNA-seq，以|log₂FC|>2且P<0.05为阈值，共鉴定781个差异表达基因（134上调，647下调）。KEGG富集提示氧化磷酸化为最显著改变通路（P<0.05），但基因集富集分析（GSEA）未达显著性，表明该通路基因差异表达但未呈现协同方向性偏移。GSEA显示复发灶中细胞周期检查点、DNA复制及抗原加工-交叉呈递通路显著上调（标准化富集得分>1，FDR<0.01）。免疫微环境分析显示，相较正常组织，LBBC肿瘤CD8⁺与CD4⁺T细胞浸润减少；而从原发到复发，总T细胞丰度增加（P<0.05），基于CIBERSORT与ssGSEA一致。

讨论总结

既往研究虽描绘过Luminal乳腺癌基因组与基因表达及内分泌治疗前后变化，但LBBC配对原发与复发灶的基因组-转录组联合研究仍少。本研究提供几点推进：首次在配对样本中平行分析基因组与转录组；发现复发灶突变景观差异明显，获得额外致癌改变，ER/PR/HER2状态常不一致；数据提示瘤内遗传异质性或可早期预测LBBC复发风险。TP53与PIK3CA为LBBC原发与复发核心突变谱，与TCGA及人群队列一致。原发第三常见突变为SPEN（23.3%），其编码的核支架蛋白作为雌激素可诱导共抑制因子衰减ERα依赖转录，缺失促内分泌耐药，或为LBBC复发候选驱动。EGFR与GNAS仅在复发灶检出，提示获得性耐药机制与靶点价值：EGFR酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）或抗体偶联药物、GNAS/cAMP/PKA与PI3K/AKT联合抑制值得在LBBC中探索。MATH量化瘤内基因组异质性（变异等位基因频率的中位绝对偏差/中位数×100），高MATH与原发LBBC较短RFS相关（log-rank P=0.032），鉴于为探索性分析且未校正多重检验，应视作假设生成；高MATH或与免疫逃逸有关，可作前瞻免疫治疗分层候选。转录组示复发灶细胞周期检查点与DNA复制通路激活，提示可能从CDK4/6抑制剂联合治疗中获益；抗原加工-交叉呈递上调伴T细胞浸润增加，或使复发LBBC对免疫检查点抑制剂（ICIs）更敏感，值得进一步研究。氧化磷酸化在KEGG显著但未在GSEA协同转向，或反映异质性代谢适应而非统一线粒体代谢偏移。局限性包括样本量偏小（尤其RNA-seq配对n=5）、组织可及性选择偏倚、原发灶混合活检与手术标本及批量肿瘤分析可能稀释信号。

结论（翻译）

综上，本研究描绘了LBBC复发伴随的基因组与转录组演化轨迹，确定SPEN、EGFR、GNAS及细胞周期调节因子等候选改变可作为潜在治疗靶点进一步研究，并为将免疫疗法、CDK4/6抑制剂及EGFR导向药物整合进预防LBBC复发、改善预后的精准策略提供假设。MATH评分与RFS的关联为探索性发现，需在独立队列中验证。