基于环状脒腙骨架的新法匹拉韦类似物的合成与首次评价

《European Journal of Medicinal Chemistry》：Synthesis and first evaluation of new favipiravir analogs based on cyclic amidrazones scaffolds

　　

在病毒（再）出现的背景下，强烈需要提出新的治疗替代方案，这也将有助于预见当前在耐药性方面显示出局限性的药物库的更新。法匹拉韦（Favipiravir）已显示出对多种病毒（西尼罗病毒（West Nile virus）、诺如病毒（Norovirus）、脑炎病毒（encephalitis viruses）、沙粒病毒（arenaviruses）、正布尼亚病毒（(ortho)bunya-virus）、埃博拉病毒（Ebola virus）、冠状病毒（coronavirus）和流感病毒（influenza viruses））具有广谱活性。在新一代高效抗病毒药物的发展过程中，设计原创的核苷（酸）抑制剂（nucleos(t)idic inhibitors）至关重要，研究人员的策略受到通过利用环状脒腙核心（cyclic amidrazone cores）作为生物电子等排体（bioisoteric compounds）对出色法匹拉韦骨架进行多样化的启发。研究人员的工作揭示了比较结合模式研究，以评估这种骨架跳跃（scaffold hopping）的相关机会。研究人员的原创策略使得两个新系列的1,4,5,6-四氢-1,2,4-三嗪-6-甲酰胺（1,4,5,6-tetrahydro-1,2,4-triazine-6-carboxamides）和5-甲酰胺-三嗪酮类似物（5-carboxamide-triazinone analogs）得以制备。它们作为抗流感候选药物的首次评估得到探索，并显示出一种中间化合物具有显著效果。然而，四种终末甲酰胺化合物并未表现出预期活性，并且可能在产生相应的代谢活性化合物方面存在局限性。拥有吸引人的构建模块，这些新骨架也应促使科学界在核苷类似物（nucleosidic analogs）或其他候选药物中带来更多结构多样性。

**研究背景与目的**
在病毒（再）出现的背景下，现有抗病毒药物面对耐药性突变的局限性日益突出。法匹拉韦（Favipiravir, T-705）作为广谱抗RNA病毒药物，虽已获批用于流感等感染，但需要高剂量给药，因其需在体内转化为核糖呋喃三磷酸活性形式，且该转化受互变异构体平衡限制；此外，流感病毒RNA依赖性RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase, RdRp）的某些突变可导致耐药。为克服这些不足，研究人员基于环状脒腙（cyclic amidrazone）作为生物电子等排体（bioisostere）的策略，设计并合成了法匹拉韦类似物，旨在通过骨架跳跃（scaffold hopping）获得具有更优理化性质和抗病毒活性的新分子。该研究发表于《European Journal of Medicinal Chemistry》。

**主要技术方法**
研究人员采用以下关键技术：①量子力学（Quantum Mechanics, QM）计算，对比法匹拉韦与环状脒腙片段的分子描述符（HOMO、LUMO、能隙、极化率）及分子静电势（Molecular Electrostatic Potential, MEP）图，验证生物电子等排假说。②分子动力学（Molecular Dynamics, MD）模拟（100 ns），分析代谢后的法匹拉韦及类似物与流感A型RdRp（PDB ID: 2VQZ）PB2亚基的结合模式，并通过MM/GBSA方法计算结合自由能。③化学合成路线：针对1,4,5,6-四氢-1,2,4-三嗪-6-甲酰胺系列，经还原胺化、环化（以原甲酸酯或原乙酸酯为关环试剂）及氨解获得目标物；针对5-甲酰胺-三嗪酮系列，经肽偶联、环化、氧化（碘苯二乙酸）及氨解合成。④体外抗病毒活性评估：利用表达Nano-荧光素酶（Nano-Luciferase, Nluc）的重组流感A(H1N1)pdm09病毒（H1N1pdm09-PA/Nluc）感染MDCK细胞（Madin-Darby犬肾细胞），感染复数（MOI）为0.1，在感染后1小时（hpi）给药，48 hpi测定荧光素酶活性，并计算半数抑制浓度（IC₅₀）和90%抑制浓度（IC₉₀）。

**研究结果**
*MD模拟与结合研究*
通过MD模拟发现，代谢后的法匹拉韦与RdRp结合位点（PB2亚基）的5个残基（Phe325、Arg355、His357、Lys376、Phe404）相互作用；而代谢后的化合物2b与9个残基（Phe325、Arg355、His357、Glu361、Lys376、Phe404、Asn429、Met431、His432）相互作用，显示出更强的结合潜力。MM/GBSA结合自由能计算表明，代谢后法匹拉韦与RdRp复合物的平均ΔG_bind为?106.19 ± 3.28 kcal/mol，代谢后2b的为?94.47 ± 4.21 kcal/mol，两者均呈有利结合，但法匹拉韦能量更优。

*合成研究*
研究人员成功合成了两个系列共9个法匹拉韦类似物：系列一为1,4,5,6-四氢-1,2,4-三嗪-6-甲酰胺（1a、1b），系列二为5-甲酰胺-三嗪酮类似物（2a、2b、9a、9b、14a、14b、15a）。其中，化合物15a为芳构化的三嗪酮酯氨解后的产物。合成路线均基于环状脒腙构建，关键步骤包括还原胺化、Boc-保护基脱除后与原酸酯环化，以及氧化芳构化等。

*体外抗病毒活性评估*
在MDCK细胞感染模型中，法匹拉韦显示出强抗病毒活性，IC₅₀ = 0.11 μM，IC₉₀ = 2.19 μM。在所评估的9个类似物中，仅化合物15a呈现剂量依赖性抑制，IC₅₀ = 5.17 μM，但最高抑制率约60%（在50 μM浓度下仍未完全清除病毒）。其余8个化合物（1a、1b、2a、2b、9a、9b、14a、14b）未表现出显著活性。所有化合物在测试浓度下均未观察到细胞毒性，15a的选择性指数>10。

**总结与讨论**
研究结论指出，法匹拉韦（T-705, Avigan?）作为靶向病毒RdRp的强效抗病毒药，对多种RNA病毒有效，但其活性依赖于体内转化为核糖呋喃三磷酸酯，且存在互变异构平衡限制。本研究首次报道了基于环状脒腙骨架的新法匹拉韦类似物的合成，其中化合物15a（来自5-甲酰胺-三嗪酮系列）表现出低微摩尔级的抗流感A(H1N1)pdm09病毒活性（IC₅₀ = 5.17 μM），但需进一步优化以改善剂量-抑制曲线。尽管代谢后的化合物2a和2b在分子模拟中与RdRp显示较强结合，但体外实验未达预期效果，可能归因于脒腙骨架中N4位亲核性较低，阻碍了其向活性代谢形式的转化。这两类新骨架（四氢三嗪甲酰胺和三嗪酮甲酰胺）可为科学界设计新型核苷类似物及抗其他RNA病毒（如沙粒病毒、诺罗病毒、正布尼亚病毒等）提供有价值的基础构建模块。未来应考虑制备这些脒腙化合物的核糖基化类似物（单磷酸化或非磷酸化）以进一步评估其潜力。