《Food Bioscience》：A Magnetic-Enrichment and Nanozyme-Catalyzed Lateral Flow Immunoassay for Authenticity Verification and Allergen Monitoring of β-Casein in Dairy Products
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王雅雅|赵双|邢晓瑞|何秋菊|卢琼蒙|李世杰|王硕天津南开大学医学院食品科学与健康重点实验室，中国天津300071摘要本文开发了一种基于磁富集-催化双重扩增侧向流动免疫层析法（M-E-C-LFIA）的新型β-酪蛋白（β-CN）定量检测方法，用于分析乳制品中的掺假成分和过敏原。该方
王雅雅|赵双|邢晓瑞|何秋菊|卢琼蒙|李世杰|王硕
天津南开大学医学院食品科学与健康重点实验室，中国天津300071
摘要
本文开发了一种基于磁富集-催化双重扩增侧向流动免疫层析法（M-E-C-LFIA）的新型β-酪蛋白（β-CN）定量检测方法，用于分析乳制品中的掺假成分和过敏原。该方法使用具有过氧化物酶活性的羧基铁四氧化物磁性纳米颗粒作为信号探针，并结合抗β-CN多克隆抗体，磁分离富集与纳米酶催化双重信号扩增技术的结合显著提高了检测灵敏度。与未经富集和催化扩增的比色法相比（视觉检出限：407 μg/L，定量检出限：101.3 μg/L），M-E-C-LFIA的视觉检出限提高了6.51倍（LOD=62.5 μg/L），定量检出限提高了4.59倍（LOD=22.3 μg/L）。该技术对水解奶粉、牛奶和乳饮料中的β-CN检测具有较高的准确性，实现了乳制品的真实性鉴定和过敏原监测，为构建完善的乳品质量与安全监测体系提供了可靠的技术支持。
引言
随着全球乳品消费向发展中国家转移，对牛奶和乳制品的需求急剧增加。据报告，未来十年南半球的乳品人均消费量预计将增加33%，这一趋势主要受到印度和中国等新兴市场庞大消费者群体的推动[1]。全球乳制品需求的增长对牛奶和乳制品的质量与安全控制提出了更高要求，无论是为了检测掺假成分、控制过敏原还是优化营养成分。目前，传统的凯氏定氮法只能测量总氮含量，无法区分蛋白质氮和非蛋白质氮，这导致掺假乳制品中的蛋白质含量被高估。这不仅危害人体健康，也违反了商业道德[2]。此外，牛奶是主要的食品过敏原之一，约占食物过敏反应的90%[3], [4]。在3岁以下的儿童中，牛奶已被确认为主要的过敏原[5]。因此，对牛奶和乳制品中的过敏原进行管理至关重要。从营养成分角度来看，人乳和牛乳的蛋白质组成存在显著差异。人乳中的β-CN是主要的酪蛋白（占总酪蛋白的68%），而在市售婴儿配方奶粉中，β-CN仅占23%。蛋白质含量是评估牛奶营养价值的关键参数，酪蛋白占总牛奶蛋白质的80%[6], [7]。因此，建立一种能够快速准确定量β-CN的分析方法对于确保乳制品的“真实性、安全性和营养性”具有重要的技术意义。
已经开发了多种检测技术来验证乳制品的真实性，包括光学免疫传感器、等电聚焦凝胶电泳[8]、毛细管电泳[9]和疏水色谱[10]。然而，这些方法通常依赖于复杂的仪器和专业技术。酶联免疫吸附测定（ELISA）是一种不需要昂贵设备且操作相对简单的生化技术，在食品分析中得到了广泛应用[11]。然而，传统的ELISA方法繁琐且耗时，需要多次洗涤和长时间孵育，限制了其在某些乳制品检测中的效率[12]。相比之下，侧向流动免疫测定（LFIA）因其简单性、快速响应和低成本而成为现场检测的首选方法[13], [14]。然而，在复杂的食品基质中，尤其是乳制品中，传统ELISA可能会因高丰度蛋白质的非特异性吸附而导致结果不准确。此外，某些乳制品中微量过敏原的含量可能低于传统比色法的检测灵敏度，进一步影响检测准确性。为了解决这些问题，研究人员最近通过改进信号标记和富集方法来提高ELISA的效率。磁性纳米颗粒（MNPs），以氧化铁纳米颗粒为代表，作为一种新型检测材料，其表面积大于传统固相载体，能够更好地附着“活性分子”，显著提高检测灵敏度[15]。免疫磁珠由于其超顺磁性，在磁场作用下可以迅速从反应系统中分离出来，并在磁场去除后重新均匀分散，形成接近“液相”的反应环境，从而促进高效的免疫反应[16], [17]。利用这一特性，可以通过磁富集将复杂基质中的微量分析物浓缩到微体积中，显著提高检测灵敏度。此外，磁珠本身的棕色可作为比色信号的直接来源。更重要的是，它们的过氧化物酶样催化特性可以用于催化显色底物反应，进一步放大信号[18], [19]。这些特点使得基于磁珠的检测方法具有高灵敏度和快速响应的特点。因此，磁珠免疫测定中采用的“富集-比色-催化扩增”集成策略具有明显优势，使其成为快速检测β-酪蛋白的理想选择。
在本研究中，我们开发了一种新的磁富集-催化双重扩增侧向流动免疫层析法（M-E-C-LFIA），使用兔多克隆抗体（pAb）和鼠单克隆抗体作为双抗体夹心ELISA格式中的捕获抗体。该方法结合免疫磁珠富集和催化双重信号扩增，能够催化3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）的颜色变化，然后使用ImageJ软件进行定量分析，以准确测量样品中的β-CN含量。与传统的商业ELISA试剂盒相比，所开发的方法在真实食品样品检测中表现出更高的特异性、灵敏度和更宽的线性范围，为β-CN的精确定量提供了可靠的工具。
章节摘录
材料
试剂和材料：样品垫、结合垫、吸水垫和PVC背板由上海金标生物有限公司（中国上海）提供；硝酸纤维素膜（NC膜）由Sartorius AG（德国哥廷根）提供；CN mAb细胞系和工作溶液在实验室中制备；β-乳球蛋白（β-LG）、α-乳白蛋白（α-LA）、β-CN（纯度≥95%）、酪蛋白、卵白蛋白（OVA）、牛血清白蛋白（BSA）、戊巴比妥等
M-E-C-LFIA检测β-CN的原理
图1示意性地展示了M-E-C-LFIA检测β-CN的原理。β-CN-mAb固定在NC膜上作为T线，羊抗兔Ab固定在NC膜上作为C线。样品与MNPs@pAb探针混合后进行磁浓缩。去除上清液后，沉淀物重新悬浮在MES缓冲液中并应用于样品垫。由于毛细作用，溶液向上移动。在β-CN阳性的样品中：1）目标物质与
结论
本研究成功开发了一种灵敏且快速的M-E-C-LFIA方法，用于乳制品中β-CN的定量检测。磁珠富集与纳米酶催化信号增强的结合使视觉检出限提高了6.5倍，定量检出限提高了4.6倍，优于传统的比色LFIA。该方法在真实样品（包括牛奶）测试中表现出宽的线性范围、良好的特异性和可靠的准确性
CRediT作者贡献声明
王硕：撰写 – 审稿与编辑、验证、监督。李世杰：撰写 – 审稿与编辑、研究、资金获取、概念构思。卢琼蒙：方法学、数据管理。何秋菊：方法学、研究、数据管理。邢晓瑞：方法学、数据管理。赵双：撰写 – 初稿、方法学、概念构思。王雅雅：撰写 – 初稿、方法学、研究、概念构思
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。
资助
本研究得到了中国国家重点研发计划（2023YFF1104700）的资助。
利益冲突声明
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