开发了一种基于不对称RPA的CRISPR/Cas12a系统，用于无需PAM（短回文序列）的情况下简便检测罗马生菜中的大肠杆菌O157:H7

《Food Control》：Development of an asymmetric RPA-based CRISPR/Cas12a system for simple PAM-free detection of Escherichia coli O157:H7 in romaine lettuce

　　

洪孝贞|金恩智|吴世旭

韩国国立大学食品与营养系，首尔136-702

摘要

大肠杆菌 O157:H7是一种主要的食源性病原体，可导致包括溶血性尿毒综合征在内的严重疾病，仍然是重大的公共卫生问题。尽管基于规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关蛋白（Cas）的诊断方法具有高特异性和敏感性，能够检测到大肠杆菌 O157:H7，但它们对目标DNA中特定序列（PAM）的严格要求限制了目标的选择范围和实际应用范围。在这项研究中，通过整合不对称重组酶聚合酶扩增（Asy-RPA）技术，开发了一种无需PAM的CRISPR/Cas12a检测系统来检测大肠杆菌 O157:H7。通过简单调整引物浓度比例，无需PAM位点即可激活Cas12a。所提出的Asy-RPA–CRISPR/Cas12a系统在纯培养物中的检测限达到10¹ CFU/mL，而对于非目标菌株，则肉眼无法观察到荧光信号。即使在罗马生菜中，该系统也能在目标菌株浓度低至10² CFU/g时被激活并产生荧光。这项研究不仅提供了一种简单的无PAM检测大肠杆菌 O157:H7的方法，而且通过调整引物浓度比例，还可以检测其他食源性细菌。

引言

大肠杆菌 O157:H7是一种主要的食源性病原体，可引发诸如溶血性尿毒综合征等严重疾病（Bai等人，2022年；Rani等人，2022年）。由于其即使在极低剂量下也能引起感染，因此在医疗基础设施有限的地区构成了特别严重的公共卫生问题（Abbas等人，2023年；Li等人，2020年）。因此，开发一种灵敏且准确的大肠杆菌 O157:H7检测方法至关重要（Forinová等人，2024年）。基于核酸的方法，如聚合酶链反应（PCR）和定量PCR（qPCR），由于其高灵敏度和特异性，逐渐成为检测的标准方法（Batra等人，2024年；Luo等人，2024年）。然而，这些方法的应用受到耗时程序、操作复杂以及需要热循环仪的限制（Wu等人，2025年）。为了解决这些问题，人们使用了仅需单一温度控制设备的等温扩增技术（Yan等人，2024年），其中RPA技术具有操作简便和反应时间短等优点（Chen等人，2025年）。然而，非特异性扩增和气溶胶介导的交叉污染等问题可能导致假阳性结果（Wei等人，2025年）。

在这种情况下，规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关蛋白（Cas）系统因其高特异性和潜在的即时检测（POCT）应用前景而受到关注（Shen等人，2024年；Song等人，2023年）。由于这些特性，CRISPR/Cas12a通常与RPA结合使用，通过提供目标信号的二次验证来提高检测准确性（Wang等人，2024a；Wei等人，2025年）。CRISPR/Cas12a由单个CRISPR RNA（crRNA）引导，识别目标双链DNA（dsDNA），并对目标序列进行顺式切割，同时对非特异性单链DNA（ssDNA）进行反向切割（Li等人，2025年；Wang等人，2024b）。当使用与荧光团和淬灭剂结合的ssDNA报告基因时，荧光信号通过反向切割被放大，从而实现目标DNA的检测（Shen等人，2024年；Wang等人，2023年）。

然而，Cas12存在结构上的限制，需要目标dsDNA中存在一个原间隔序列（PAM）才能激活切割（Yang等人，2023年）。理论上，PAM位点的出现频率很低，约为256个核苷酸组合中的3个，因此在基因组dsDNA中的出现频率有限（Ma等人，2025年；Wei等人，2024年）。这使得病原基因、菌株特异性标记或高突变概率的区域可能不在PAM兼容范围内，从而在目标选择和引物设计中引入不必要的限制（Ai等人，2025年；Chen等人，2023年；Collias & Beisel，2021年）。因此，对PAM的依赖性使得有效引物集的应用变得困难，并成为人为限制CRISPR/Cas12a目标设计空间的结构瓶颈（Huang等人，2025a）。因此，需要一种无需PAM位点的检测策略（Zhang等人，2022年）。在这方面，已经提出了几种在食品基质中无PAM检测食源性病原体的方法。例如，Ng等人（2025年）使用外切酶将dsDNA转化为ssDNA来检测牡蛎样本中的弧菌属细菌。此外，Sun等人（2025年）引入了基于伪肽骨架的合成DNA聚合物（PNAs），生成ssDNA产物来检测鸡蛋、牛奶和果汁中的鼠伤寒沙门氏菌。Meng等人（2024年）在引物设计阶段加入限制性酶切割位点，从而检测鱼样本中的化脓性链球菌。然而，这些方法依赖于额外的酶、合成成分或额外的处理步骤，增加了反应复杂性、成本和操作负担，从而限制了其在POCT中的适用性。

本研究提出了一种基于不对称RPA（Asy-RPA）的CRISPR/Cas12a系统，用于简单、易操作且经济高效地检测罗马生菜中的大肠杆菌 O157:H7，罗马生菜是一种常与大肠杆菌 O157:H7爆发相关的即食食品。Asy-RPA通过简单调整引物浓度比例在扩增过程中选择性生成ssDNA，从而在没有PAM位点的目标上也激活Cas12a。Luo等人（2024年）之前报道了一种用于检测罗马生菜中大肠杆菌 O157:H7的RPA–CRISPR/Cas12a方法，证明了基于CRISPR的检测在同一食品基质中的可行性。然而，他们的系统仍然依赖于含有PAM的目标。Huang等人（2025a）报道了使用传统RPA的无PAM CRISPR/Cas12a检测大肠杆菌 O157:H7的方法，但他们的方法需要额外的酶处理步骤来生成ssDNA以实现无PAM检测。相比之下，Asy-RPA–CRISPR/Cas12a系统通过调整引物浓度比例生成ssDNA产物，无需额外材料或工作流程，实现了简单且经济高效的无PAM检测大肠杆菌 O157:H7。尽管已有报道将Asy-RPA和CRISPR/Cas12a结合用于有限的临床或病毒模型（Cao等人，2023年；Zhang等人，2025年；Zou等人，2025年），但尚未有研究探讨Asy-RPA–CRISPR/Cas12a系统在复杂食品基质中检测食源性病原体的适用性。此外，还探讨了将该系统整合到简化的一管法POCT中的可行性。据我们所知，这是首次报道使用Asy-RPA–CRISPR/Cas12a系统在食品基质中无PAM检测大肠杆菌 O157:H7的应用，强调了其在POCT中的潜力。因此，本研究旨在开发和评估Asy-RPA–CRISPR/Cas12a系统在罗马生菜中无PAM检测大肠杆菌 O157:H7的应用，重点验证无PAM的Cas12a激活、优化反应条件，并评估其灵敏度、特异性和在一管法中的适用性。

章节片段

菌株

大肠杆菌 O157:H7 ATCC 43895被用作优化Asy-RPA–CRISPR/Cas12a系统的目标菌株。另外三种目标菌株（大肠杆菌 O157:H7 ATCC 35150、大肠杆菌 O157:H7 ATCC 43889和大肠杆菌 O157:H7 ATCC 43898）以及八种非目标菌株（大肠杆菌 NCCP 13718、鼠伤寒沙门氏菌 ATCC 14028、肠炎沙门氏菌 ATCC 13067、金黄色葡萄球菌 ATCC 25923、无害李斯特菌 ATCC 33090、单核细胞增生李斯特菌 ATCC 19114、宋内志贺菌 ATCC 25931和坂崎肠杆菌

Asy-RPA–CRISPR-Cas12a系统的检测原理

该系统的操作原理和工作流程如图1所示。Cas12a特异性识别目标序列上游含有T富集PAM的dsDNA，并由单个crRNA引导，从而激活周围ssDNA的非特异性切割（Du等人，2025年）。然而，食源性病原体（如大肠杆菌 O157:H7）的基因组DNA在提取后以dsDNA形式存在，传统的基于Cas12a的检测方法需要crRNA目标序列附近的PAM位点

结论

本研究开发了一种Asy-RPA–CRISPR/Cas12a系统，用于在罗马生菜中无PAM检测大肠杆菌 O157:H7。通过简单调整引物浓度比例，该系统能够在没有PAM位点的情况下生成能够激活Cas12a的ssDNA产物，从而缓解了传统依赖PAM的CRISPR/Cas12a检测方法的目标选择限制。重要的是，这一策略的实施无需额外材料或对

CRediT作者贡献声明

洪孝贞：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿撰写，可视化，验证，方法学，研究，数据分析，概念化。金恩智：撰写 – 审稿与编辑。吴世旭：撰写 – 审稿与编辑，监督，项目管理

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致谢

本研究得到了韩国国家研究基金会（NRF）通过基础科学研究计划（RS-2025-25437992）的支持，该计划由教育部（）资助（）。