衣壳完整性RT-qPCR方法的优化用于定量悬浮液和熟食肉样品中热灭活的戊型肝炎病毒

《Food Microbiology》：Optimization of a capsid integrity RT-qPCR method to quantify thermally inactivated hepatitis E virus in suspensions and in deli meat samples

　　

戊型肝炎病毒（HEV）属于Paslahepevirus balayani种（Hepeviridae科），携带正链单链RNA基因组。HEV基因型3和4（HEV-3和HEV-4）主要通过动物储库（主要为家猪）传播，途径包括直接接触或食用感染动物的肉。热处理是猪肉产品中灭活HEV的主要食品技术工艺。为评估此类灭活处理的有效性，必须实施稳健的HEV感染性评估方法。尽管多种细胞系对HEV易感，但基于细胞培养的方法仍存在若干缺点（高技术水平要求、耗时、通量低）。本研究旨在优化衣壳完整性RT-qPCR（capsid-integrity-RT-qPCR）方法，用于研究HEV在简单基质（PBS、细胞培养基）中的热抗性，验证其在熟食肉产品（熟火腿和乳化香肠）中的应用，并将其性能与使用HepaRG细胞的细胞培养方法进行比较。在多个候选物中，PtCl₄被确定为最有效的衣壳完整性标记物，可结合病毒RNA；2.5 mM PtCl₄浓度对测试的两种热灭活HEV-3株（HEV-3c和HEV-3f）实现了基因组滴度的最大降低，且不影响完整病毒颗粒的病毒基因组。衣壳完整性RT-qPCR在食品基质（熟火腿和乳化香肠）中成功验证，无论测试哪一毒株，热灭活HEV均实现>4 log₁₀的降低。敏感性分析表明，在悬浮液和食品基质中，可可靠检测低至2 log₁₀基因组当量/mL的感染性HEV。当应用于评估≥63 °C持续≥5分钟或≥75 °C持续5分钟的热灭活效果时，研究结果显示HEV有效灭活，分子检测方法与细胞培养检测方法呈现平行趋势。衣壳完整性RT-qPCR显示HEV基因组滴度呈时间和温度依赖性降低，且与细胞培养方法中观察到的感染性丧失相关。这些发现支持将衣壳完整性RT-qPCR用作评估HEV热灭活的有效一线筛选工具，并在可行时辅以细胞培养方法，尤其针对复杂食品基质。这两种方法的互补使用旨在进一步评估，以验证食品工业中的病毒灭活工艺。

**研究背景与问题**
戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus, HEV）属于Paslahepevirus balayani种（Hepeviridae科），为正义单链RNA病毒。HEV基因型3和4（HEV-3和HEV-4）主要通过家猪等动物储库传播，食用未煮熟的猪肉制品是主要食源性风险。热处理是工业及家庭加工猪肉产品时灭活HEV的关键工艺，但评估灭活效果的可靠方法仍存在不足。现有细胞培养方法（如使用A549、HepaRG等细胞系）虽可检测感染性病毒，但存在技术要求高、耗时长、通量低等缺点，且HEV不引起细胞病变效应（cytopathic effect, CPE），需依赖RT-qPCR或免疫染色等替代读数，操作复杂且成本高昂。为解决这些问题，亟需一种快速、稳健且能区分完整与受损病毒颗粒的分子检测方法。衣壳完整性RT-qPCR（capsid-integrity-RT-qPCR）已在人诺如病毒等难培养肠道病毒中应用，但尚未在食品基质中系统评估HEV。本研究旨在优化该方法，用于定量热灭活HEV在简单基质（PBS、细胞培养基）和熟食肉产品（熟火腿和乳化香肠）中的感染性，并对比细胞培养方法。该论文发表在《Food Microbiology》。

**关键技术与方法**
研究人员主要采用了以下关键技术：1）衣壳完整性标记物筛选：比对3种单叠氮化物和5种铂衍生物（包括PtCl₄、PtCl₆、K₂PtCl₄、K₂PtCl₆和PtCl₂）结合病毒RNA的能力；2）PtCl₄浓度优化：测试0.5、1.0、2.5、5.0和10 mM浓度对热灭活HEV-3c和HEV-3f毒株的影响；3）细胞培养方法：使用HepaRG细胞系（来源：BIOPREDIC International）进行感染性滴定，通过RT-qPCR终点稀释法计算TCID₅₀；4）样本来源：病毒悬液（PBS或细胞培养基）及人工污染的热火腿和乳化香肠食品基质；5）热灭活处理：在63 °C（2、5、10 min）和75 °C（2、5 min）条件下处理病毒样本。

**研究结果**
**1. 衣壳完整性标记物的选择**
通过处理纯化HEV RNA并检测RT-qPCR的Ct值变化（ΔCt），发现单叠氮化物（如PMA、PEMA、PMAxx）几乎无结合能力（ΔCt < 1），而铂衍生物中PtCl₄和K₂PtCl₄表现出最高RNA结合效率（ΔCt分别为6.8和5.2）。PtCl₄被选为最优标记物。

**2. PtCl₄浓度的优化**
对热灭活（95 °C, 5 min）的HEV-3c和HEV-3f毒株，测试不同浓度PtCl₄（0.5–10 mM）。2.5 mM PtCl₄时，基因组滴度降低最大（Δlog₁₀分别为3.1和2.6），且未影响完整病毒颗粒的RNA扩增（Δlog₁₀ < 0.2）。更高浓度（5和10 mM）对完整病毒也产生抑制，故选定2.5 mM。

**3. 优化后方法在病毒悬液中的性能**
在PBS和细胞培养基中，热灭活（70、80、90 °C, 5 min）的HEV-3c和HEV-3f毒株，经衣壳完整性RT-qPCR检测，基因组滴度降低>4 log₁₀，且与热灭活温度呈正相关。

**4. 在食品基质中的应用**
在熟火腿和乳化香肠中，热灭活（70、80、90 °C, 5 min）的HEV-3f毒株，衣壳完整性RT-qPCR检测到基因组滴度降低>4 log₁₀，与悬液结果一致。基质对方法性能无显著干扰。

**5. 敏感性分析**
通过对稀释的感染性HEV悬液进行检测，该方法在悬液和食品基质中均可可靠检测低至2 log₁₀基因组当量/mL的病毒，与细胞培养方法的检测限相当。

**6. 与细胞培养方法的比较**
在63 °C（2、5、10 min）和75 °C（2、5 min）热灭活条件下，衣壳完整性RT-qPCR与HepaRG细胞培养法（TCID₅₀）的灭活趋势高度一致：两种方法均显示63 °C 5 min后病毒完全灭活（低于检测限），75 °C 2 min后无明显差异。Pearson相关系数r = 0.98（悬液）和0.96（食品基质），表明分子方法与感染性结果良好相关。

**7. 热灭活动力学**
研究人员在多种温度和时间点下检测HEV-3f的基因组滴度变化，发现随温度升高和时间延长，滴度呈指数下降。例如，63 °C 2 min降低约2.5 log₁₀，5 min后降低>4 log₁₀；75 °C 2 min降低约3.5 log₁₀，5 min后完全灭活。

**讨论与结论**
讨论部分指出：现有HEV灭活评估方法（如细胞培养）存在低通量和耗时问题，而衣壳完整性RT-qPCR作为一种快速分子工具，可有效区分完整与受损病毒颗粒。本研究中，PtCl₄作为衣壳完整性标记物表现出高效性，且优化浓度（2.5 mM）可抑制受损病毒RNA扩增而不影响完整病毒，适用于HEV-3c和HEV-3f两种基因型。在食品基质（熟火腿和乳化香肠）中，该方法成功检测到热灭活引起的>4 log₁₀降低，且与细胞培养结果高度相关，表明其可作为一线筛选工具，尤其在复杂基质中。然而，该方法不能完全替代细胞培养，因后者仍是评估感染性的金标准；但两者互补使用可提高验证效率。研究结论翻译如下：这些发现支持将衣壳完整性RT-qPCR用作评估HEV热灭活的有用一线筛选工具，并在可行时辅以细胞培养方法，尤其针对复杂食品基质。这两种方法的互补使用旨在进一步评估，以验证食品工业中的病毒灭活工艺。