综述：不同食品基质中异尖线虫物质的检测方法：一项系统综述

《Food and Waterborne Parasitology》：Methods for the detection of anisakid material in different food matrices: A systematic review

　　

异尖科线虫（Anisakidae）是常见的食源性寄生线虫，对海产品安全和公共卫生具有重要意义。除了因摄入活幼虫引起的典型症状外，这些线虫还含有致敏蛋白，即使在无活幼虫的情况下也可能引发过敏反应。当前工业环境的检测方法主要局限于肉眼检查和灯光透视检查（candling），这是欧盟法规所要求的，但这些方法灵敏度有限，无法检测幼虫去除后残留的肉眼不可见过敏原。在科研环境中，常用高灵敏度方法如紫外压榨法（UV-press）和人工消化法，但同样不能检测过敏原。替代检测方法可能对海产品加工业及科研环境有价值。研究人员对痕量异尖线虫物质的检测方法进行了系统综述，以PubMed、Web of Science、Scopus和Google Scholar为数据库，仅纳入聚焦食品基质中异尖线虫检测的英文文献，排除基于视觉检测的方法。共识别出25篇文章，按检测原理分类，其中10种为DNA检测方法（DNA-based），14种为免疫化学检测方法（immunochemistry-based），5种为质谱检测方法（mass spectrometry-based，MS-based）。各方法的检测性能参数报告缺乏标准化，阻碍了全面比较。研究人员推荐使用化学发光夹心酶联免疫吸附试验（chemiluminescent sandwich ELISA）进行食品过敏原的常规分析；对于幼虫DNA检测，环介导等温扩增法（LAMP）似乎是快速常规DNA检测中最有前景的方法；当需要痕量检测异尖线虫物质时，质谱法（MS-based）最为有效。

论文主体部分系统地总结了异尖线虫物质在不同食品基质中的检测方法，涵盖DNA检测、免疫化学检测和质谱检测三类方法。

**1. 引言（Introduction）**
异尖科线虫（Anisakidae）包括异尖线虫属（Anisakis）、蟾蜍线虫属（Phocanema，以前归为伪新地线虫属Pseudoterranova）和对盲囊线虫属（Contracaecum），是全球海洋生态系统中的人兽共患寄生虫，常见于多种鱼类和头足类动物。传统上，这些线虫因摄入活幼虫导致胃肠道感染（anisakidosis）。此外，异尖线虫（如简单异尖线虫Anisakis simplex）的耐热蛋白可引发过敏反应，目前已有14种过敏原被世界卫生组织/国际免疫学联合会（WHO/IUIS）正式认可。欧盟法规（EC）No. 853/2004要求对生食或轻度加工的水产品进行冷冻处理以确保无活幼虫，但此过程可能不足以灭活致敏蛋白。近期证据表明，养殖鱼类也可能含有异尖线虫，且过敏原可通过受污染饲料（如鱼粉）传播。工业检测主要依赖视觉检查（如灯光透视法candling），灵敏度有限，且无法检测幼虫去除后的分子痕迹（如排泄分泌蛋白和细胞外囊泡）。科研领域已开发出多种方法，包括免疫测定、分子诊断（聚合酶链式反应PCR、实时荧光定量PCR qPCR、环介导等温扩增LAMP）、蛋白质组学方法和下一代测序（NGS）技术，这些方法在检测限、特异性、通量和适用基质方面差异显著。

**2. 方法（Methods）**
采用PRISMA指南进行系统检索，在PubMed、Web of Science、Scopus和Google Scholar中执行布尔逻辑检索策略，关键词涉及异尖线虫属（Anisakis）、蟾蜍线虫属（Phocanema）、伪新地线虫属（Pseudoterranova）和对盲囊线虫属（Contracaecum）的DNA、蛋白质或肽段检测，限英文文献（2006年1月至2025年6月）。经过逐级筛选（去重、标题摘要筛选、全文筛选），最终纳入27篇文献。数据提取按检测原理分为DNA检测、免疫化学检测和质谱检测三类，提取内容包括方法类型、靶向物种、基质类型、检测限（LOD）等性能参数。

**3. 结果（Results）**
**3.1 DNA检测方法（DNA-based methods）**
DNA检测方法通过靶向物种特异性遗传物质间接指示过敏原可能存在，适用于需要高物种特异性检测及加工产品中幼虫碎片不可见的情况。共12篇文献描述了DNA检测方法。

**3.2 DNA检测方法总结（Summary of DNA-based methods）**
DNA检测方法分为常规聚合酶链式反应（conventional PCR）、实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-PCR）、高通量测序（HTS）和环介导等温扩增（LAMP）四类。常规PCR研究（2篇）靶向18S核糖体RNA基因或核糖体内部转录间隔区I（ITS-1），检测限（LOD）报告不一（如1:100,000异尖线虫DNA/鱼DNA或1:6250幼虫组织/鱼组织）。RT-PCR研究（8篇）多靶向线粒体细胞色素c氧化酶亚基II（COII）基因，LOD从0.00032 ng/μL到1 ppm幼虫组织不等，部分使用TaqMan探针系统。HTS研究（1篇）使用微型条形码引物（COI区域）分析鱼饲料，检出80%样本中有线虫遗传物质。LAMP方法（1篇）靶向ITS-2基因，LOD为0.00022 ng/μL，灵敏度100%，可区分Anisakis属与其他属。DNA提取方法包括CTAB酚-氯仿法、Wizard系列试剂盒、QIAamp试剂盒等。

**3.3 免疫化学检测方法（Immunochemistry-based methods）**
免疫化学方法基于抗原-抗体相互作用检测过敏原，包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫染色（immunostaining）和免疫组织化学（immunohistochemistry）。共14篇文献描述了此类方法。

**3.4 免疫化学检测方法总结（Summary of Immunochemistry-based methods）**
ELISA方法（8篇）使用多克隆抗血清（靶向粗提物或特定过敏原）或单克隆抗体（如抗Ani s 1、抗Ani s 7），基质包括新鲜鱼、高度加工鱼类（如鱼粉、鱼酱）。检测限（LOD）报告单位多样，如0.3–5 mg/kg鱼蛋白、2.5–5 larvae/kg鱼、0.5–40 ng/mL，缺乏标准化。免疫染色方法（5篇）使用患者血清（含IgE或IgG）或多克隆抗体，LOD约0.2–2 μg粗提物/g食品，针对Ani s 4时更低（2.5–5 ng/g）。免疫组织化学方法（4篇）使用多克隆兔抗Ani s 4或抗粗提物抗血清，定性评估过敏原空间分布，但未报告检测限，且仅用于未加工鱼类。

**3.5 质谱检测方法（Mass spectrometry-based methods）**
质谱（MS）方法通过质量电荷比（m/z）直接鉴定致敏蛋白肽段，具有高灵敏度和多重分析能力。共5篇文献描述了相关方法。

**3.6 质谱检测方法总结（Summary of mass spectrometry-based methods）**
分为非靶向蛋白质组学（untargeted proteomics，2篇）和靶向蛋白质组学（targeted proteomics，3篇）。非靶向方法使用nano-LTQ-Orbitrap MS，鉴定A. simplex血红蛋白的特异性肽段（如HSWTTIGEEFGHEADK、LFAEYLDQK）。靶向方法采用多反应监测（MRM）或平行反应监测（PRM），如AQUA-LC-TripleQ-MS/MS靶向Ani s 8和Ani s 13的独特报告肽，最低检测限（LLA）为0.5–1 μg/mL；或使用IonKey-三重四极杆MS靶向所有WHO认可的A. simplex过敏原。蛋白质提取常用PBS缓冲液，胰酶消化过夜（或超声快速消化）。LOD报告最明确的是F?ste等（2016），AQUA法对肽LFAEYLDQK的LOD为0.5 μg/mL。

**4. 讨论（Discussion）**
总体上，各方法的性能报告缺乏标准化，建议未来研究采用标准化报告指南：DNA检测方法使用MIQE指南（报告LOD单位如拷贝/μL），免疫化学方法使用STARD指南（真/假阳性结果交叉表），质谱方法使用MIAPE指南（详述实验设计、定量方法、置信区间）。DNA检测方法可区分属种，假阳性率较低，但无法检测幼虫去除后残留的耐热过敏原（如Ani s 4、Ani s 9）——这些过敏原可能通过免疫化学或质谱方法检出。免疫化学方法直接检测蛋白质，但需注意交叉反应（如Ani s 2、Ani s 3与节肢动物、尘螨的交叉反应），可通过靶向特异性过敏原（Ani s 1、Ani s 4、Ani s 7）避免。质谱方法灵敏度最高（低fmol/μL范围），可绝对定量和多重分析，但设备昂贵、方法开发复杂，商业化潜力有限。

**5. 结论（Conclusion）**
对于海产品中异尖线虫过敏原的常规分析，Kochanowski等（2020）描述的化学发光夹心ELISA法（CL-S-ELISA）最为灵敏和简便。对于幼虫DNA检测，推荐Cammilleri等（2020）的LAMP法（低LOD、快速简便）。在需要最低检测限的科学研究中，建议使用基于质谱（MS）的方法，靶向异尖线虫血红蛋白肽或SXP/RAL-2蛋白（如Ani s 8或Ani s 9）的肽段。