恢复由BECN1介导的自噬作用可减轻氧化锌纳米颗粒引起的急性肺损伤

《Free Radical Biology and Medicine》：Restoring BECN1-Mediated Autophagy Mitigates Acute Lung Injury Caused by Zinc Oxide Nanoparticles

　　

毛乐娇|谭美玲|姜学军|张军|徐戈|张玉佳|张珊珊|高彩霞|秦霞|陈成志|邹珍

重庆医科大学实验医学学院，临床实验室诊断重点实验室（中国教育部），中国重庆400016

摘要：

人类吸入氧化锌纳米颗粒（ZnONPs）会引发金属烟雾热，而在动物实验中则会导致急性肺损伤（ALI）。先前的研究表明，自噬参与了ZnONPs诱导的ALI的发病机制，其中BECN1/Beclin1依赖的自噬和线粒体自噬起着核心作用。在本研究中，与Becn1⁺/⁺对照组相比，Becn1⁺/^-杂合缺陷小鼠在暴露于ZnONPs后表现出更严重的ALI。免疫沉淀-质谱分析显示，ZnONPs改变了BECN1蛋白相互作用网络，富集了与自噬、线粒体自噬和线粒体质量控制相关的通路。此外，Becn1单倍体不足会干扰自噬进程，导致线粒体自噬体中积累功能失调的线粒体。值得注意的是，给予Tat-Beclin1（一种可穿透细胞膜的自噬诱导肽）能有效缓解Becn1⁺和Becn1^+/-小鼠因ZnONPs引起的ALI。关键的是，巨噬细胞特异性Becn1敲除小鼠再现了加重的损伤表型，表明髓系BECN1是关键的细胞保护因子。从机制上讲，Tat-Beclin1恢复了自噬进程并促进了线粒体降解，从而减少了活性氧（ROS）的产生和炎症级联反应。这些发现表明，通过Tat-Beclin1药理学恢复BECN1水平为治疗纳米颗粒引起的金属烟雾热和ALI提供了一种可行的策略。

引言

金属氧化物污染中的锌（Zn）主要以气溶胶形式的氧化锌纳米颗粒（ZnONPs）存在，其尺寸通常在0.01至0.10 μm之间，浓度范围为0.1至30.0 mg/m³ [1]。这些颗粒广泛应用于工业、化妆品和家庭领域，同时在抗癌、抗菌和药物递送等方面也显示出显著的生物医学潜力 [2]、[3]、[4]。冶炼和焊接等职业活动可能导致大量暴露。人类吸入5 mg/m³的ZnONPs持续2小时会引发金属烟雾热，症状包括呼吸困难、发热和类似流感的症状 [5]。严重病例在放射学上可能与急性呼吸窘迫综合征（ARDS）相似 [6]。独立研究及我们之前的研究均表明，ZnONPs在肺部暴露会导致啮齿动物出现急性肺损伤（ALI），主要通过氧化应激和炎症介导 [7]、[8]。当ZnONPs被肺上皮细胞内吞后，会在酸性内体和中溶酶体内溶解，释放出游离锌离子 [9]。这些离子以及残留的颗粒会损害细胞成分，尤其是线粒体，导致活性氧（ROS）的过度产生。这种细胞损伤随后会引发免疫细胞（如巨噬细胞和中性粒细胞）的募集，从而加剧ALI [7]。此外，有证据表明，ZnONPs可能通过激活小鼠肺上皮细胞中的芳烃受体（AhR） [10] 或破坏内皮紧密连接和粘附连接 [11] 来引发急性肺部或全身性炎症。然而，ZnONPs对这些募集的免疫细胞的精确直接影响以及驱动炎症级联反应的具体限速因素仍有待阐明。

自噬是一种进化上保守的分解代谢过程，对细胞稳态至关重要 [12]。其选择性形式——线粒体自噬有助于清除功能失调的线粒体，这对于减轻ALI中的氧化应激尤为重要 [13]。这些通路的启动在很大程度上依赖于Beclin 1（BECN1），这是自噬的核心调节因子 [14]。BECN1不是一个静态的支架，而是一个动态的中心，能够整合上游的应激信号来指导细胞命运 [15]。在肺部病理中，BECN1信号表现出复杂且依赖于情境的功能二分性，既可能保持组织完整性，也可能加剧损伤。例如，肺炎链球菌激酶StkP会磷酸化BECN1，导致紧密连接蛋白过度降解，从而破坏肺泡屏障 [16]。相反，在败血症引起的ALI中，E3连接酶TRIM21介导BECN1的泛素依赖性降解，从而抑制自噬活性并促进巨噬细胞的促炎表型 [17]。因此，稳定BECN1成为一种有前景的治疗策略，如抗炎混合物已被证明可以恢复BECN1水平，改善自噬活性，并减少败血症引起的肺损伤 [18]。然而，目前仍缺乏关于ALI进展过程中BECN1调控网络的全面和细胞类型特异性的图谱。这一知识空白限制了靶向疗法的发展。

虽然我们之前的研究发现ZnONPs在体外可诱导肺上皮细胞发生自噬介导的细胞死亡，但BECN1在体内的功能及其细胞特异性机制仍不清楚 [19]。为了解决这个问题，我们在一个特征明确的ZnONPs诱导的ALI模型中使用了Becn1杂合（Becn1^+/-）和野生型（Becn1⁺⁺）对照组。这种遗传方法至关重要，因为纯合Becn1缺失会在E7.5时导致胚胎致死 [20]。我们进一步评估了Tat-Beclin1的治疗效果，这是一种先前已被证明能在多种疾病背景下恢复自噬活性的强效自噬诱导肽 [21]、[22]、[23]。通过整合免疫沉淀-质谱（IP-MS）和细胞类型特异性的敲除模型，我们分析了ZnONPs对BECN1相互作用网络的干扰，并确定了关键的保护性细胞群体。因此，本研究提供了关于纳米生物相互作用的机制见解，并提出了针对ALI的靶向治疗途径。

章节片段

试剂和纳米颗粒表征

氧化锌纳米颗粒（ZnONPs，目录编号677450）购自Sigma-Aldrich，报道的初级颗粒尺寸小于50 nm。我们对本研究中使用的纳米颗粒进行了全面的表征。透射电子显微镜（TEM）显示其大致呈球形，平均直径约为50 nm。场发射扫描电子显微镜结合能量色散光谱（FESEM-EDS）确认了其中含有锌（Zn）和氧（O）。当分散在2%

暴露于ZnONPs的Becn1^+/-小鼠表现出加重的急性肺损伤

基于我们之前建立的ZnONPs诱导的ALI小鼠模型（暴露后3天出现症状高峰），我们选择了0.6 mg/kg的暴露剂量和3天的检测时间点 [7]、[24]。实验前，通过PCR基因分型尾部分泌的基因组DNA确认Becn1⁺小鼠仅显示野生型条带（1060 bp），而Becn1^+/-小鼠同时显示野生型和敲除型条带（1130 bp），这与最初的表征结果一致 [29]。

讨论

我们的研究表明，BECN1在巨噬细胞中对抵抗ZnONPs诱导的ALI具有关键的保护作用。BECN1的基因敲低加剧了肺损伤和炎症反应，而Tat-Beclin1的治疗有效逆转了这些病理变化。巨噬细胞的关键作用进一步通过细胞特异性敲除实验得到证实，这些实验反映了全身性BECN1减少时观察到的损伤模式。在机制层面，BECN1维持自噬

CRediT作者贡献声明

陈成志：撰写——审稿与编辑，概念构思。秦霞：概念构思。高彩霞：实验研究。张珊珊：实验研究。张玉佳：实验研究。徐戈：实验研究。张军：实验研究。姜学军：实验研究，数据管理。谭美玲：实验研究，数据管理。毛乐娇：撰写——初稿，实验研究，数据管理。邹珍：撰写——审稿与编辑，概念构思

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（编号81903358）、重庆市自然科学基金（编号CSTB2023NSCQ-MSX0312和CSTB2025NSCQ-GPX1227）、重庆市教育委员会的科学技术研究计划（编号KJQN202200459）、重庆市科学与西部数字智能医学研究所的资助