NAT10对PDK4的ac4C修饰通过重编程成纤维细胞线粒体动力学促进肺纤维化

《Free Radical Biology and Medicine》：ac4C modification of PDK4 by NAT10 promotes pulmonary fibrosis by reprogramming mitochondrial dynamics in fibroblasts

　　

特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一种进行性且致命的肺部疾病，治疗选择有限，因此需要识别新的发病机制和治疗靶点。在此，研究人员报道了RNA乙酰转移酶NAT10通过表观转录调控线粒体代谢在驱动肺纤维化中的关键作用。研究人员发现，在IPF患者和博来霉素（bleomycin）处理小鼠的纤维化肺组织中，特别是活化的成纤维细胞内，NAT10及其催化的N4-乙酰胞苷（ac⁴C）修饰显著上调。成纤维细胞中NAT10的基因敲除显著减轻了纤维化进展，而其过表达则加剧了病理过程。机制上，整合转录组学和生化分析确定丙酮酸脱氢酶激酶4（pyruvate dehydrogenase kinase 4，PDK4）为关键下游靶点，其mRNA稳定性因NAT10介导的ac⁴C修饰而增强。这种转录后调控导致PDK4上调，进而促进线粒体分裂（mitochondrial fission）和活性氧（reactive oxygen species，ROS）产生，从而驱动成纤维细胞向肌成纤维细胞转化（fibroblast-to-myofibroblast transition）和细胞外基质（extracellular matrix，ECM）过度沉积。此外，研究人员阐明了NAT10的上游调控机制，证明转化生长因子-β1（transforming growth factor-beta 1，TGF-β1）通过Smad3直接与NAT10启动子结合，转录诱导NAT10表达，形成维持纤维化激活的正反馈环路。该研究揭示了NAT10-ac⁴C-PDK4轴作为肺纤维化中线粒体动力学的核心调控因子，并强调NAT10是恢复代谢稳态和改善纤维化肺重塑的有前景的治疗靶点。

**论文解读：NAT10介导的ac⁴C修饰调控PDK4促进肺纤维化——线粒体动力学重编程的新机制**

**研究背景**
特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一种慢性、进行性且致死性极高的间质性肺疾病，全球发病率约为9.8/10万人年，并以每年约6%的速度递增。目前美国食品药品监督管理局（FDA）仅批准吡非尼酮和尼达尼布两种药物，但二者只能延缓疾病进展，无法逆转纤维化，且常伴有显著副作用。IPF发病机制复杂，涉及遗传易感性、表观遗传改变和环境损伤，核心事件是肺泡上皮细胞反复损伤后成纤维细胞异常激活，分化为α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）阳性的肌成纤维细胞，导致细胞外基质（ECM）过度沉积。转化生长因子-β1（TGF-β1）作为关键驱动因子，通过Smad2/3磷酸化促进成纤维细胞增殖、分化和ECM产生。然而，在RNA表观转录修饰层面，N4-乙酰胞苷（ac⁴C）及其唯一催化酶N-乙酰转移酶10（NAT10）在肺纤维化中的作用尚未明确。同时，线粒体动力学（融合与分裂的平衡）失调在肺纤维化中已被证实，但成纤维细胞中代谢与结构重编程的分子调控机制仍不清楚。丙酮酸脱氢酶激酶4（PDK4）作为代谢关键酶，抑制丙酮酸脱氢酶复合物，促进糖酵解，在纤维化肺组织中表达升高，但其功能意义及是否受表观转录调控尚未知。因此，本研究旨在解析NAT10能否通过表观转录调控线粒体代谢基因，驱动成纤维细胞激活和肺纤维化进展。

**研究内容**
研究人员围绕NAT10-ac⁴C-PDK4轴，系统探究了其在IPF发病中的作用和机制。发现NAT10和ac⁴C在IPF患者和博来霉素（bleomycin）诱导的小鼠肺组织中显著上调，尤其富集于活化成纤维细胞。通过成纤维细胞特异性基因敲除和过表达模型，证实NAT10是纤维化进展的必要和促进因子。机制上，NAT10通过ac⁴C修饰增强PDK4 mRNA稳定性，导致PDK4蛋白上调，进而诱导线粒体分裂和活性氧（ROS）产生，促进成纤维细胞向肌成纤维细胞转化。上游调控方面，TGF-β1通过Smad3直接结合NAT10启动子，转录上调其表达，形成正反馈环路。该研究发表于《Free Radical Biology and Medicine》。

**主要技术方法**
研究使用了IPF患者肺组织样本（来源于无锡市人民医院2019-2024年收集，经伦理委员会批准）和博来霉素诱导的小鼠肺纤维化模型。主要关键技术包括：
- 转录组分析：利用GEO公共数据集（Fig.1A）比较IPF与正常肺组织NAT10 mRNA表达水平。
- 免疫组化（IHC）和免疫荧光（IF）：检测NAT10、ac⁴C、PDK4等在肺组织中的定位和表达。
- 蛋白印迹（Western blot）：定量分析NAT10、PDK4、线粒体分裂蛋白DRP1等表达。
- RNA稳定性测定：通过放线菌素D处理评估PDK4 mRNA半衰期，结合ac⁴C RIP（RNA免疫沉淀）验证NAT10直接修饰。
- 荧光素酶报告基因和染色质免疫沉淀（ChIP）：验证Smad3与NAT10启动子结合。
- 线粒体形态分析：使用MitoTracker染色和共聚焦显微镜评估线粒体分裂程度。
- 基因敲除小鼠：成纤维细胞特异性NAT10敲除（NAT10^fl/fl;Col1a2-Cre）小鼠模型。

**研究结果**
**NAT10和ac⁴C修饰水平在肺纤维化中上调**：通过GEO数据集分析发现IPF肺组织中NAT10 mRNA显著高于对照组；免疫组化和免疫荧光验证显示NAT10蛋白及ac⁴C修饰在IPF患者和博来霉素模型小鼠的纤维化病灶中明显增加，尤其定位于α-SMA阳性的活化成纤维细胞。
**成纤维细胞中NAT10缺失减轻纤维化，过表达加重病理**：成纤维细胞特异性NAT10敲除小鼠在博来霉素处理后，肺纤维化程度（羟脯氨酸含量、胶原沉积、肌成纤维细胞标志物）显著减轻；相反，NAT10过表达加剧纤维化。
**PDK4是NAT10介导ac⁴C修饰的关键下游靶点**：整合转录组学（RNA-seq）和生化分析（ac⁴C RIP-seq）鉴定PDK4 mRNA为NAT10的直接靶标。NAT10敲低显著降低PDK4 mRNA稳定性，而ac⁴C修饰位点突变实验证实NAT10通过增强PDK4 mRNA稳定性上调其表达。
**PDK4通过诱导线粒体分裂和ROS产生促进成纤维细胞转化**：在成纤维细胞中，PDK4过表达增加线粒体分裂（DRP1 Ser616磷酸化增强）和ROS水平，同时促进α-SMA和Collagen I表达；PDK4敲低则逆转这些效应。NAT10缺失引起的纤维化抑制可被PDK4过表达部分恢复，表明PDK4是关键介质。
**TGF-β1通过Smad3转录激活NAT10形成正反馈**：TGF-β1处理上调NAT10 mRNA和蛋白水平；ChIP和荧光素酶实验证实Smad3直接结合NAT10启动子区。NAT10上调后稳定TGF-β1 mRNA（同时增强下游信号），形成前馈环路放大纤维化信号。

**总结讨论**
本研究揭示了一个此前未被认识的以RNA乙酰转移酶NAT10为中心的表观转录调控轴，该轴通过控制线粒体动力学和成纤维细胞激活驱动肺纤维化。具体而言，TGF-β1/Smad3信号诱导NAT10表达，NAT10通过ac⁴C修饰稳定PDK4 mRNA，导致PDK4上调，进而促进DRP1介导的线粒体分裂，增加ROS产生，推动成纤维细胞向肌成纤维细胞转化和ECM沉积。该发现填补了RNA乙酰化与线粒体重编程在纤维化发病中联系的知识空白。研究的结论是：NAT10-ac⁴C-PDK4轴是肺纤维化中线粒体动力学的核心调控因子，靶向NAT10可能成为恢复代谢稳态、改善纤维化肺重塑的有前景的治疗策略。