CD301b+ 组织驻留巨噬细胞作为早期响应的亚群，在骨骼修复过程中发挥关键作用

《International Immunopharmacology》：CD301b+ tissue-resident macrophages drive bone repair as an early-responding subpopulation

　　

周小杰|曾浩|曲书源|李娇娇|罗喜珍|谭坤|顾斌|赵琴|王蛟龙

江西医学院口腔医学院，南昌大学，南昌330006，中国

摘要

骨骼愈合是一个复杂的免疫调节过程。具体而言，驻留于骨组织中的巨噬细胞（TRMs）在这一过程中起着关键作用。此外，TRMs在骨骼环境中表现出特定的功能异质性。然而，特定TRM亚群在骨骼修复过程中的功能贡献和分子机制仍不甚明了。通过结合单细胞RNA测序和体内功能检测，我们发现了一种独特的CD301b⁺TRM亚群，该亚群在损伤后迅速扩增。这种亚群通过高表达CD301b和典型的驻留标记物Timd4来定义。伪时间分析和RNA速度分析证实，CD301b⁺TRMs在平行进化模型中作为关键的转录前体细胞发挥作用。这些细胞通过Ptn和Gas6轴调控早期信号网络的重塑，招募巨噬细胞并驱动其向促修复和成骨状态转变。功能研究表明，特异性耗竭这种亚群会损害小鼠的骨骼再生能力，表现为矿化骨体积显著减少、胶原沉积紊乱以及关键成骨因子（如Sp7）的丢失。本研究确立了CD301b作为识别促修复TRMs的可靠生物标志物。我们的发现强调了CD301b⁺TRMs在骨免疫微环境中的关键调节作用，并提示其作为治疗各种骨科再生问题的潜在靶点。

引言

成功的骨骼再生需要一个平衡的免疫-骨骼微环境[1] [2]。组织驻留巨噬细胞（TRMs）是一类长期存在于不同生理微环境中的巨噬细胞亚群，负责维持全身和局部稳态[3] [4] [5]。它们在感知组织损伤和维持局部稳态方面起着关键作用[4] [5]。TRMs具有独特的发育起源和自我更新能力[6]。最近在多种炎症模型中的研究表明，组织驻留巨噬细胞作为损伤的早期传感器，并协调后续单核细胞的招募[7] [8]。这种时间层次结构表明，驻留巨噬细胞是初始炎症反应的主要启动者[9] [10]。虽然这种快速响应是其他器官组织修复的基本特征，但尚不清楚骨骼驻留巨噬细胞是否遵循类似的时间模式。特别是，这些驻留巨噬细胞在骨骼组织再生级联反应启动中的具体功能贡献尚未得到明确。

重要的是，组织内的TRMs并非一个均匀的群体，而是表现出显著的功能异质性[3]。这种多样性源于不同的起源[11]。具体来说，由卵黄囊前体或胎儿单核细胞衍生的亚群与骨髓来源的亚群共存[12] [13]。最近在心脏和肺等器官中的研究发现了具有不同生理功能的多个TRM亚群[4] [14]。例如，由VSIG4等标记物定义的心脏特异性巨噬细胞对组织重塑和稳态至关重要[15]。鉴于这种微环境特异性适应，骨骼系统也可能存在类似的TRM异质性[16]。在这种框架下，骨组织的独特微环境可能作为专门的空间微环境，驱动不同的转录谱型[17]。这种内部复杂性预计会调节从炎症消退到成骨的转变[18] [19]。因此，识别这些不同的TRM亚群对于确定它们对骨骼修复的具体贡献至关重要。

单细胞RNA测序（scRNA-seq）提供了一种强大的工具，可以解析这种异质性，从而识别罕见的细胞亚群并追踪它们在组织修复过程中的谱系轨迹[20]。通过利用高通量转录组分析，可以识别出与骨骼再生相关的关键驱动亚群，并精确绘制它们从稳态到修复状态的动力学变化[21]。在这些转录组方法的指导下，找到骨骼系统中促修复TRMs的可靠生物标志物具有重要意义。在潜在候选者中，Mgl2基因编码的CD301b蛋白在各种软组织中的TRM亚群中广泛表达。我们之前的研究表明，CD301b⁺巨噬细胞在生物材料介导的骨骼形成中起着重要作用[22]，而靶向耗竭这种亚群会显著加速骨骼吸收[23] [24] [25]。然而，CD301b尚未被明确确立为骨骼系统中组织驻留的典型标志物[26]。更重要的是，这些细胞在急性骨损伤期间的确切细胞身份、时空招募动态和进化轨迹仍完全未知。

本研究旨在利用scRNA-seq系统地绘制小鼠骨折修复过程中的时空免疫微环境。我们发现了一类特异性表达CD301b的TRM亚群，它们在损伤早期表现出显著的微环境感知和免疫调节活性。通过将转录轨迹分析与使用Mgl2^DTR小鼠进行的功能细胞耗竭实验相结合，我们证明了CD301b⁺TRMs是启动骨骼愈合不可或缺的亚群。这项研究阐明了CD301b⁺TRM介导的细胞间通信在驱动成骨谱系分化中的关键作用。我们的发现确立了CD301b作为骨骼驻留巨噬细胞的可靠生物标志物。此外，这项研究为通过免疫调节促进骨骼修复提供了新的理论基础。

章节片段

scRNA-seq的数据收集与处理

公开的scRNAseq数据集来自Gene Expression Omnibus[GSE192630] [26]。关于样本管理和数据采集的更多细节在之前的研究中已有描述。原始测序数据（FASTQ格式）使用seeksoultools软件管线（版本1.3.0）进行处理[27]。读段被比对到小鼠参考基因组（GRCm39/mm39）以生成特征条形码矩阵。后续分析使用Seurat R包（版本5.3.0）进行[28]。

骨骼愈合过程中的免疫微环境特征

为了研究免疫细胞在骨骼再生中的具体作用，有必要对局部免疫微环境和基因表达谱进行表征。因此，我们分析了一个公共的单细胞RNA测序数据集。在该数据集中，Yao等人收集了手术前、术后第5天和术后第10天的股骨样本。这种采样策略非常适合我们的研究。术前样本提供了稳态基线。

讨论

本研究确定了CD301b⁺巨噬细胞作为骨膜微环境中的独特组织驻留亚群。虽然骨损伤后的早期免疫反应涉及多种免疫细胞的快速招募[32]，但我们的发现表明，再生级联反应的启动主要由预先存在的TRMs控制，而不仅仅是单核细胞衍生的亚群[33] [34]。通过将单细胞转录组分析与蛋白质水平分析相结合

结论

本研究确定了CD301b作为骨骼免疫微环境中TRMs的可靠生物标志物。CD301b⁺TRMs通过损伤后的快速扩增和功能状态转变在启动骨骼再生中起着关键作用。从功能上讲，这个亚群通过Gas6和Ptn旁分泌信号通路调节成骨前体细胞的分化。这些发现阐明了驻留免疫亚群在骨免疫学中的功能异质性。此外，这项工作还

CRediT作者贡献声明

周小杰：撰写——原始草稿、软件、资源、项目管理、方法学、研究、正式分析、数据管理、概念化。曾浩：撰写——原始草稿、软件、资源、项目管理、方法学、研究、正式分析、数据管理、概念化。曲书源：方法学、数据管理。李娇娇：软件、数据管理。罗喜珍：数据管理、概念化。谭坤：数据管理、概念化。顾斌：

伦理批准

所有使用的小鼠均饲养在无特定病原体的环境中。8周大的雌性C57BL/6小鼠来自北京Vital River公司。Mgl2^DTR小鼠来自Jackson实验室。所有程序均符合ARRIVE指南2.0，并获得了中国武汉大学口腔医学院和医院的动物护理和使用批准（S0792403121）。

资助

本研究得到了国家自然科学基金（82201078、82401192、52263015）、中国博士后科学基金（2025M772606）、江西省自然科学基金（20252BAC220055）以及江西省赣鄱精英人才计划-创新高层次人才项目（医学与健康领域青年人才，gpyc20250233）的支持。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。