细胞外囊泡作为移植物抗宿主病治疗选择的应用：体内研究的系统综述

《International Immunopharmacology》：Use of extracellular vesicles as a therapeutic option for graft-versus-host disease: systematic review of in vivo studies

　　

细胞外囊泡（EVs）可作为涉及免疫学机制疾病的的治疗选择，包括移植物抗宿主病（GVHD）。本研究通过系统综述评估了EVs用于GVHD治疗的适用性。该研究遵循PRISMA推荐意见进行，旨在回答PICO问题："在GVHD动物模型中，与非EVs治疗相比，EVs治疗有何效果？"。研究人员对不同数据库进行了系统检索，时间截止至2025年5月。GVHD的控制及其涉及的分子机制分别作为主要结局和次要结局。采用SYRCLE的RoB工具评估所选研究的偏倚风险。共分析了3468篇文章，在应用纳入排除标准后，最终纳入14项研究。研究表明，EVs可控制GVHD的发展，减轻组织炎症过程，抑制细胞凋亡，提高存活率，并减轻损伤，尤其在皮肤、肝脏和肠道方面表现明显。EVs给药后，研究人员观察到抗炎细胞因子和调节性T细胞增加，而炎症细胞因子以及Th1和Th17淋巴细胞的活化则降低。EVs与动物模型中GVHD的控制相关；然而，在临床应用前，仍需进一步研究最佳细胞来源、剂量以及安全性和有效性。

## 一、研究背景与目的

移植物抗宿主病（Graft-versus-host disease, GVHD）是造血干细胞移植（Hematopoietic stem cell transplantation, HSCT）后最常见的并发症，以过度炎症反应为特征，导致组织损伤和受者靶器官进行性衰竭，尤其累及皮肤、胃肠道和肝脏。该病死亡率较高，2016年全球38,425例接受异基因HSCT的患者中，30%–50%发生I–IV级急性GVHD，14%发生III–IV级急性GVHD。2024年Schm?lter等基于欧洲血液与骨髓移植学会注册数据对1,540例成人患者的分析显示，移植后100天内II–IV级和III–IV级急性GVHD发生率分别为31.7%和15.5%。GVHD危险因素包括HLA不相容程度、无关供者使用、女性供者男性受者、外周血干细胞移植物以及预处理方案强度等。

GVHD病理生理学涉及T淋巴细胞（T细胞）活化及后续其他细胞活化，最终导致组织损伤。活化的同种反应性CD4⁺ T细胞诱导促炎细胞因子（主要为IFNγ和TNF-α）信号传导，触发炎症过程，造成靶细胞凋亡和坏死；同时CD8⁺ T细胞发挥细胞毒性作用，损伤胃肠道、肝脏和上皮组织。

一线治疗为糖皮质激素，但其有效率仅约50%，难治性病例总体生存期不足一年，且伴随感染、糖耐量异常、骨质疏松、无菌性坏死、白内障、水肿以及精神症状等副作用。二线治疗目前尚无共识，美国食品药品监督管理局（U.S. Food and Drug Administration, FDA）已批准依鲁替尼（ibrutinib）、芦可替尼（ruxolitinib）和贝莫苏地尔（belumosudil）用于GVHD治疗，但这些药物均伴有疲劳、腹泻、恶心、咳嗽、肺炎、肺出血、肌肉痉挛、高血压、心房心律失常、贫血、中性粒细胞减少、真菌和巨细胞病毒感染、高血糖、肝功能异常、血小板减少、外周水肿和败疫等不良反应，且部分患者因毒性而停药，部分药物对III–IV级GVHD无效。

近年研究表明，利用间充质干细胞（Mesenchymal stem cells, MSCs）或细胞外囊泡（Extracellular vesicles, EVs）的治疗显示出良好前景。EVs可由多种细胞类型分泌，其中MSCs尤为突出，具有免疫抑制功能。根据大小，EVs可分为小细胞外囊泡（small extracellular vesicles, sEVs，<200 nm）和大细胞外囊泡（large extracellular vesicles, lEVs，>200 nm）；根据生物发生，源于内体系统的sEVs可称为外泌体（exosomes）。EVs通过抑制同种反应性T细胞的活化和向靶组织的迁移，从而预防炎症和组织损伤，其组织修复能力甚至与MSCs相当或更优。因此，采用EVs替代MSCs输注的无细胞策略为GVHD治疗提供了新方向。

2021年Gupta等的系统综述识别了4项评估EVs用于GVHD小鼠模型治疗或预防的研究，报告了疾病严重程度降低、生存改善和组织改变减少的结果。2025年Wu等的叙述性综述探讨了EVs在GVHD诊断、监测和治疗中的作用，报告了EVs用于早期诊断和减轻疾病严重程度的潜力，并指出需要进一步研究以更好地理解EV治疗涉及的免疫和分子机制，以及细胞来源、剂量和EV类型的影响。

基于此，本系统综述旨在更新EVs用于GVHD的知识，详细分析EVs在疾病预防和控制中的分子机制，评估治疗中使用的细胞来源、囊泡类型和剂量，为未来研究和治疗策略提供参考。研究问题为：在GVHD动物模型中，与非EVs治疗相比，EVs治疗有何效果？

## 二、研究方法概述

本系统综述遵循PRISMA指南进行，在PROSPERO平台注册（CRD42024593047）。纳入标准为：（I）体内研究；（II）涉及EVs和GVHD的研究；（III）EVs使用与非使用的比较研究；（IV）考虑EVs细胞来源类型的研究；（V）评估EVs剂量（剂量和给药途径）的研究；（VI）分析EVs在GVHD预防和控制中涉及的分子机制的研究。排除标准包括：未模拟GVHD的体内动物模型、未分析GVHD、无对照比较、未分析EVs治疗GVHD的分子机制、未分析EVs细胞类型、未分析EVs剂量和给药形式、使用EVs模拟物，以及综述、非比较研究、评论、社论、病例报告、病例系列、会议摘要、临床病例、计算机模拟和体外研究。

系统检索在PubMed/MEDLINE、Scopus和Cochrane Library数据库进行，时间截止2025年5月，同时在Open Gray数据库检索灰色文献。由两名独立研究人员根据标题和摘要筛选研究，采用Kappa统计量评估一致性（κ=0.803，几乎完全一致）。偏倚风险评估采用SYRCLE的RoB工具，该工具专门针对动物研究设计，包含10个条目：（1）分配序列产生（选择偏倚）、（2）基线组间相似性（选择偏倚）、（3）分配隐藏（选择偏倚）、（4）饲养条件相似性（实施偏倚）、（5）干预措施盲法（实施偏倚）、（6）随机结局评估（检测偏倚）、（7）结局评估者盲法（检测偏倚）、（8）不完整结局数据（失访偏倚）、（9）选择性结局报告（报告偏倚）、（10）其他偏倚来源。原计划进行荟萃分析，但因多数研究仅以图形或图像格式报告结果，缺乏对照组和EV治疗组的确切均数及标准差数值，且联系原作者后仅一名作者提供了原始数据，加之研究间异质性较大，故无法行荟萃分析，转而依据SWiM（无荟萃分析综合）报告指南与PRISMA建议进行结果综合。

## 三、研究结果

### 3.1 纳入研究特征

共分析3,468篇文献，去重并应用纳入排除标准后，最终纳入14项研究。所有纳入研究均使用小鼠实验模型，发表语言主要为英文，仅Liu等的研究为中文（研究人员使用Google翻译将该文翻译为母语进行分析）。受试小鼠来源地包括中国、美国、德国、日本和法国；供体小鼠来源地包括中国、美国、新加坡和日本，其中Dal Collo等和Zhang等的研究采用来自健康人的细胞进行异种移植。

受试动物品系包括Balb/c、SPF级Wistar、NOG、NSG和B6D2F1（BDF1）等，以雌性为主。供体动物用于骨髓和/或脾脏细胞移植，品系包括SPF级SD（Sprague Dawley）、C57BL/6 J和B10.D2等。GVHD诱导采用标准化方案：移植前全身照射（Total body irradiation, TBI），剂量1–8.5 Gy不等，照射后4–6小时经静脉移植骨髓细胞和脾脏细胞；骨髓细胞剂量为0.5×10⁷至6×10⁷，脾脏细胞剂量为0.05×10⁷至6×10⁷。Dal Collo等和Zhang等使用1×10⁶至2×10⁷个人外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells, PBMCs）替代小鼠骨髓和/或脾脏细胞。

绝大多数研究使用sEVs进行无细胞治疗，3项研究同时分析了sEVs和lEVs。所有研究均按MISEV2018和MISEV2023指南进行EVs提取和表征，提取或分离方法包括超速离心、离心、过滤或特定试剂盒；表征方法包括透射电子显微镜（Transmission electron microscopy, TEM）、纳米颗粒跟踪分析（Nanoparticle tracking analysis, NTA）、动态光散射（Dynamic light scattering, DLS）、蛋白质印迹（Western blot, WB）、流式细胞术、酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）和双缩脲酸（Bicinchoninic acid, BCA）测定等。

细胞来源包括骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells, BM-MSCs）、人脐带间充质干细胞（Human umbilical cord mesenchymal stem cells, hUC-MSCs）和皮肤成纤维细胞。大多数研究经静脉给药，少数研究采用腹腔注射。研究持续时间为11至100天，评估参数包括GVHD评分、Kaplan-Meier生存曲线、流式细胞术、ELISA、苏木精-伊红（Hematoxylin and eosin, H&E）染色、免疫荧光、京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）分析、流式微球阵列（Cytometric bead array）和免疫组织化学等。

### 3.2 偏倚风险

选择偏倚方面，多数研究随机化方法不明确（不清楚偏倚风险），仅5项研究报告了随机 splitted 随机化（低偏倚风险）；所有研究基线特征和分配隐藏均为低偏倚风险和不清楚偏倚风险。实施偏倚方面，除Li等的研究因报告动物未随机饲养而评为高偏倚风险外，其余研究均不清楚。检测偏倚方面，多数研究不清楚，仅5项研究因评估者盲法评为低偏倚风险。失访偏倚方面，多数研究为低偏倚风险；报告偏倚方面，全部研究均为低偏倚风险；其他偏倚来源方面，2项研究因利益冲突和EVs表征分析方法问题评为高偏倚风险，4项研究不清楚，8项研究为低偏倚风险。

### 3.3 主要结局：GVHD控制

临床评分改善方面，EVs治疗组GVHD临床评分降低至2–5分，而GVHD对照组为4–10分。EVs治疗减轻了体重下降、精神萎靡、毛发脱落和弓背姿势等临床症状。组织学评估显示，EVs减少了GVHD靶器官（皮肤、肝脏、肠道、肺和脾脏）的炎症和组织损伤，表现为肝脏门脉区和结肠炎症细胞浸润减少、肠道绒毛保留和隐窝破坏减轻、肺内炎症细胞及细支气管上皮水肿和鳞状上皮增厚减少、表皮结构恢复（无严重表皮增生、角化不全和表皮层增厚）、脾脏炎症减轻及部分 architecture 保留并与脾肿大减轻相关。

Hackel等和Dal Collo等的研究虽显示临床改善，但未检测到炎症减少或组织修复方面的积极变化。Madel等的研究表明临床差异可能取决于所使用的EVs批次。Su等发现EVs与三氧化二砷（Actin-Target, ATO）联合使用可改善单独使用时的效果不足。Jiang等和Liu等报告了干细胞治疗和细胞无治疗在GVHD控制方面的相似性。

### 3.4 次要结局：分子机制

炎症细胞因子调节方面，EVs显著降低促炎细胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-12、IL-17A、IL-21、IL-22、CXCL1和G-CSF等水平，同时增加抗炎细胞因子IL-10和TGF-β水平。一项研究报告了IL-5增加和TNF-α降低，提示Th1向Th2转换；另一项研究报告了Th17细胞减少。

免疫细胞调节方面，EVs增加调节性T细胞（Regulatory T cells, Tregs, CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺）水平，降低CD4⁺/CD8⁺比值。sEVs通过作用于RORγt/STAT3和Foxp3通路，降低IL-2、IL-17A、IL-21和IL-22，同时增加Foxp3和IL-10。

细胞凋亡与氧化应激方面，EVs抑制ATF6/CHOP通路，降低C-CASP-3和BAX，增加BCL-2，抑制CD4⁺ T细胞凋亡，促进CD4⁺IL-10⁺ T细胞分化。EVs降低活性氧（Reactive oxygen species, ROS）、8-OH-dG和丙二醛（Malondialdehyde, MDA）等氧化应激标志物，同时增加过氧化氢酶（Catalase, CAT）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase, SOD）和总抗氧化能力（Total antioxidant capacity, T-AOC）。

巨噬细胞极化方面，EVs抑制mTOR通路，促进M1向M2巨噬细胞极化，减少M1相关细胞因子（TNF-α、IL-6和IL-1β），增加M2相关细胞因子（IL-10和TGF-β）。

微小RNA（microRNA, miRNA）机制方面，sEVs主要通过miR-16-5p和miR-125a-3p发挥作用，前者与抑制ATF6/CHOP通路、调节活化CD4⁺ T细胞凋亡相关；后者与减轻组织应激、调节炎症反应相关。

## 四、讨论与结论

### 4.1 讨论总结

EVs作为膜结合囊泡，由真核细胞分泌至细胞外环境，含有脂质、蛋白质、黏附分子和RNAs等细胞内信号分子，可由T细胞、肥大细胞、树突状细胞、肿瘤细胞、MSCs和内皮细胞等多种细胞类型分泌。由于其纳米级尺寸，EVs可迁移至各种组织，抑制同种反应性T细胞的活化和向靶组织的迁移，从而预防炎症和组织损伤。

本系统综述的结果与Gupta等和Wu等的报道一致，表明EVs具有治疗和预防GVHD相关组织损伤、体重减轻和临床改变的潜力。在免疫机制方面，GVHD由供体T细胞对受者组织的识别、活化和分化介导，Th1细胞主要分泌IL-2、IFN-γ和TNF-α等促炎细胞因子，Th17细胞表达IL-17A、IL-21、IL-22和IL-12，共同参与GVHD诱导；而Th2细胞表达IL-4、IL-5、IL-6和IL-10等抗炎细胞因子，Treg细胞表达IL-10和TGF-β，可减轻GVHD。

本综述数据显示，EVs显著降低促炎细胞因子并增加抗炎细胞因子，减少Th1和Th17细胞，增加Th2和Treg细胞。Treg细胞对抑制自身免疫和维持免疫稳态至关重要，其数量和活性增加有利于移植后免疫耐受的建立，使免疫系统无需持续的全身性免疫抑制即可避免排斥反应。

EVs还通过作用于RORγt/STAT3和Foxp3通路发挥免疫调节作用：抑制STAT3通路和Th17细胞的分化，减少RORγt表达，进而降低IL-17A、IL-21和IL-22的产生；同时增加Foxp3表达，促进Treg细胞分化和IL-10分泌，主动抑制移植排斥中的炎症反应。

在细胞凋亡和氧化应激方面，内质网（Endoplasmic reticulum, ER）应激诱导的CD4⁺ T细胞凋亡可能是GVHD相关免疫紊乱的原因之一。氧化应激可通过ROS等氧化标志物量化EVs通过作用于ATF6/CHOP通路，平衡氧化代谢途径，减轻GVHD相关炎症；通过抑制BAX/BCL-2/C-CASP-3凋亡轴，减少CD4⁺ T细胞凋亡，发挥保护效应。

巨噬细胞极化方面，M1巨噬细胞具有促炎特性，促进T细胞向Th1和Th17亚群分化，与TNF-α和IL-1β相关；M2巨噬细胞为抗炎表型，诱导Treg分化，与TGF-β和IL-10相关。EVs抑制mTOR通路，促进M1向M2极化，增强自噬，减少炎症。

在细胞来源方面，BM-MSCs来源的EVs在多数研究中与GVHD症状和体征控制及生存率提高相关，而hUC-MSCs来源的EVs单独使用效果可能有限，但与ATO联合使用可提高生存率，提示EVs可能作为递送载体，增强治疗剂的 biodistribution 和协同效应。皮肤成纤维细胞来源的sEVs未显示显著效果，表明不同细胞来源的EVs therapeutic potential 存在差异。此外，Madel等报告了不同EVs批次间 therapeutic potential 的变异性，提示批次一致性和质量控制是临床转化前的关键变量。

剂量和给药途径方面，研究间剂量范围从1 μg至300 μg不等，因给药方案和动物品系差异，直接比较受限，需进一步研究确定最佳剂量和给药时机。给药途径主要为静脉注射和腹腔注射，均为实验设置常用途径。

### 4.2 研究结论

在动物模型中，EVs与GVHD的控制相关。EVs能够控制GVHD的发展，减轻组织炎症过程，抑制细胞凋亡，提高存活率，并减轻皮肤、肝脏和肠道等靶器官的损伤。其作用机制涉及增加抗炎细胞因子（IL-10、TGF-β）和Treg细胞，减少促炎细胞因子（TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-6等）以及Th1和Th17淋巴细胞的活化。然而，在临床应用前，仍需进一步研究确定最佳细胞来源和剂量，并开展转化研究评估其安全性和有效性，以支持其在人体中的潜在临床应用。