巨噬细胞衍生的外泌体miR-146b-5p通过调节TRAF6/NF-κB通路，加剧了过敏性哮喘中ILC2介导的炎症反应

《International Immunopharmacology》：Macrophage-derived exosomal miR-146b-5p exacerbates ILC2-mediated inflammation in allergic asthma by regulating the TRAF6/NF-κB pathway

　　

刘颖|魏莉|高星星|钱晓军|尹莉|薛伟

安徽医科大学公共卫生学院职业卫生与环境健康系，合肥230032，中国

摘要

目的

2型先天淋巴细胞（ILC2）是2型炎症反应的关键驱动因素。本研究旨在探讨巨噬细胞衍生的细胞外囊泡在过敏性哮喘发病机制中调节ILC2细胞的机制，从而为该疾病的预防、诊断和治疗提供新的证据和方向。

方法

建立了卵白蛋白诱导的过敏性哮喘小鼠模型。通过超速离心从支气管肺泡灌洗液（BALF）中分离巨噬细胞衍生的外泌体，随后进行miRNA测序分析。使用Deseq2软件和RT-qPCR筛选并验证关键miRNA及其富集的通路；通过尾静脉注射miRNA-146b-5p模拟物在哮喘小鼠中进行体内实验。后续评估包括苏木精-伊红（H&E）染色、Masson三色染色、TUNEL荧光、肺功能测试、RT-qPCR、Western blot分析和ELISA。这些方法评估了miRNA-146b-5p模拟物对肺炎症、肺功能、ILC2细胞增殖以及产生的炎症细胞因子（IL-4、IL-5、IL-13）和TRAF-6/NF-κB通路的影响；体外实验：将巨噬细胞外泌体与ILC2细胞共培养，然后通过ELISA检测ILC2相关的炎症细胞因子并进行Western blot分析。

结果

与正常小鼠相比，过敏性哮喘小鼠的肺泡灌洗液中的巨噬细胞外泌体中有99个miRNA上调，92个miRNA下调。差异表达的miRNA在NF-κB等通路中显著富集。通过将前50个差异表达的miRNA与候选通路进行交集，得到三个候选miRNA：mmu-miR-181b-5p、mmu-miR-146b-5p和mmu-miR-222-3p。测序和RT-qPCR验证显示，miR-146b-5p在模型组中显著下调，TRAF-6基因表达和NF-κB通路活性上调。将miRNA-146b-5p模拟物通过尾静脉注射到模型组小鼠中可减轻肺炎症浸润，改善肺功能，并降低ILC2相关的炎症细胞因子（IL-4、IL-5、IL-13、IL-25、IL-33、TSLP）的水平；巨噬细胞外泌体与ILC2细胞共培养表明，哮喘小鼠的外泌体促进了ILC2细胞的增殖。与miRNA-146b-5p模拟物共培养可抑制ILC2细胞的增殖并降低NF-κB通路的表达。

结论

含有miR-146b-5p的肺泡巨噬细胞衍生的细胞外囊泡通过靶向TRAF6/NF-κB信号通路促进ILC2细胞激活和炎症细胞因子的释放，从而加剧过敏性哮喘的病理进展。外源性补充miR-146b-5p模拟物可以有效抑制TRAF6/NF-κB通路的激活，从而减轻ILC2介导的炎症反应。这为过敏性哮喘的预防和治疗提供了新的潜在靶点和理论依据。

引言

2型先天淋巴细胞（ILC2）是过敏性哮喘中2型炎症反应的关键效应细胞[1]。与适应性免疫细胞不同，它们的激活不依赖于抗原呈递，而是由组织微环境中的复杂信号网络精确调控。这些网络涉及上皮细胞、神经元、基质细胞以及其他免疫细胞，如肺泡巨噬细胞和树突状细胞[2]。激活后，ILC2迅速产生大量细胞因子，包括IL-4、IL-5、IL-9和IL-13[3]，这些细胞因子促进嗜酸性粒细胞浸润、黏液过度分泌和气道高反应性——使ILC2成为哮喘的重要治疗靶点[4]、[5]。

作为组织驻留的免疫调节剂，巨噬细胞通过直接细胞接触或分泌因子（如IL-1和IL-33）调节ILC2的激活、增殖和细胞因子产生，形成关键的免疫调节轴[5]。巨噬细胞表现出多种极化状态（M1和M2），这些状态对炎症有不同的影响；然而，巨噬细胞亚群通过外泌体miRNA调节ILC2的机制仍不清楚[6]、[7]。外泌体是细胞分泌的40–200纳米的细胞外囊泡，携带多种生物活性蛋白质和核酸[8]，是细胞间通信的重要介质。值得注意的是，外泌体衍生的分子可以增强ILC2的功能[9]。巨噬细胞是外泌体的活跃产生者[10]，它们封装的miRNA随着其极化状态（M1/M2）和微环境的变化而动态变化，从而对靶细胞产生多种调节作用[11]、[12]。其中，miR-146b-5p已被确定为多种情况下免疫激活的负调节因子[13]，但其在巨噬细胞衍生的外泌体中的作用及其对过敏性哮喘期间ILC2的影响尚未直接阐明。

关于肺泡巨噬细胞衍生的外泌体miRNA对过敏性哮喘中ILC2介导的炎症的调节作用及其潜在机制，仍存在关键知识空白。特别是miR-146b-5p及其下游信号通路的作用尚未明确。阐明巨噬细胞衍生的外泌体miRNA调节ILC2的作用和机制可能揭示连接先天免疫和适应性免疫的新通信机制，为过敏性哮喘的发病机制提供新的见解。本研究旨在验证巨噬细胞衍生的外泌体miR-146b-5p通过TRAF6/NF-κB通路调节ILC2激活的假设。

部分摘要

动物实验

雌性BALB/c小鼠（3–4周龄，16–18克）由北京VTLL实验动物技术有限公司提供，并在特定无病原体（SPF）条件下饲养。所有动物实验均按照美国国立卫生研究院的《实验室动物护理和使用指南》（出版号8523）进行，并得到合肥市第三人民医院伦理委员会的批准（批准号2023LLW081）。本研究的报告遵循ARRIVE指南

过敏性哮喘小鼠模型的建立

通过卵白蛋白致敏和激发成功建立了过敏性哮喘模型（图1A示意图，方法细节见第2.1节）。模型组小鼠的肺组织中表现出显著的炎症浸润，并伴有肺功能受损（图2A）。对肺泡灌洗液中的巨噬细胞进行流式细胞术分析，显示模型组中主要为M1型巨噬细胞（图2B）。从巨噬细胞中分离出外泌体

讨论

本研究表明，肺泡巨噬细胞外泌体中miR-146b-5p的表达降低会通过TRAF6/NF-κB通路增强ILC2驱动的炎症，从而加重过敏性哮喘的病理。据我们所知，这些发现为过敏性哮喘中由肺泡巨噬细胞、外泌体miR-146b-5p和ILC2组成的免疫调节轴提供了新的证据。尽管如此，miR-146家族成员在其他炎症性疾病中的相关调节作用已有文献记载[26]

结论

本研究表明，肺泡巨噬细胞外泌体中miR-146b-5p的减少通过TRAF6/NF-κB通路增强ILC2的激活和细胞因子产生，从而加重过敏性哮喘。外源性miR-146b-5p的输送通过抑制这一信号级联反应减轻了气道炎症并改善了肺功能。这些发现提示了一种涉及巨噬细胞-外泌体-ILC2轴的新发病机制，并支持进一步研究基于miRNA的过敏性哮喘治疗方法

CRediT作者贡献声明

刘颖：撰写——原始草稿，正式分析。魏莉：正式分析。高星星：数据管理。钱晓军：撰写——审阅与编辑，资金获取。尹莉：数据管理。薛伟：数据管理。

资金来源

本研究得到了合肥市科学技术局（GJ2022SM06）的关键共性技术研发项目、安徽省卫生健康委员会（AHWJ2023A30064）的研究项目、合肥市卫生健康委员会（HFSZYYYJ2024-‐07）的传统中医项目、安徽省中医药管理局（2024CCCX042）以及高级研究所的应用科学技术成果培育计划的支持

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

我们衷心感谢所有为这项研究做出贡献的人。我们感谢实验室同事们的宝贵技术支持和富有洞察力的讨论，这些帮助我们深入研究了巨噬细胞衍生的外泌体miR-146b-5p在ILC2介导的过敏性气道炎症中的作用。特别感谢我们的老师在TRAF6/NF-κB信号通路调节方面的关键指导。我们也感谢所提供的财政支持