改良黄连温胆汤通过激活AMPK/ULK1通路恢复自噬并抑制炎症改善糖尿病前期肾损伤

《International Immunopharmacology》：Modified Huanglian Wendan Decoction improves prediabetic renal injury by activating the AMPK/ULK1 pathway to restore autophagy and suppress inflammation

　　

背景：糖尿病前期（prediabetes）是介于正常血糖与糖尿病之间的中间代谢状态，以胰岛素抵抗、代谢紊乱及低度炎症为特征，可导致早期肾损伤，表现为肾小球高滤过、尿微量白蛋白排泄增加及肾小管亚临床损伤，但该阶段肾损伤常被忽视。明确其分子机制并早期干预可延缓肾功能下降。改良黄连温胆汤（Modified Huanglian Wendan Decoction, MHWD）虽已被证实可调节糖脂代谢，但其对糖尿病前期肾损伤的作用及机制尚不清楚。方法：研究人员采用超高效液相色谱-质谱联用（UPLC-MS）分析MHWD主要活性成分；建立高脂饮食联合链脲佐菌素（streptozotocin, STZ）诱导的糖尿病前期大鼠模型，评估MHWD对胰岛素敏感性、体重、血糖及血脂谱的影响；对肾组织行转录组学与蛋白质组学分析探讨分子机制并在体内验证；体外采用高糖处理的HK-2细胞，用氯喹（chloroquine, CQ）评估自噬在抗炎中的作用，检测自噬相关蛋白及炎性细胞因子；以二甲双胍（metformin）为阳性对照评估MHWD对AMPK/ULK1通路、自噬及炎症反应的影響，并用AMPK抑制剂Compound C验证保护作用是否依赖AMPK/ULK1通路。结果：UPLC-MS鉴定出MHWD中15种主要化学成分。MHWD改善糖尿病前期大鼠糖代谢紊乱、胰岛素抵抗、血脂异常及体重增加，减轻肾损伤及全身与肾脏局部炎症。转录组与蛋白组学提示MHWD主要通过代谢调节、恢复自噬及抗炎发挥作用。透射电镜、免疫荧光及Western blot证实MHWD通过AMPK/ULK1通路恢复肾脏自噬并抑制炎症。高糖诱导HK-2细胞中重现上述效应且与二甲双胍相当；氯喹或Compound C抑制MHWD的保护作用，表明MHWD的肾脏保护及抗炎效应由AMPK/ULK1依赖性自噬介导，从而减轻糖尿病前期代谢紊乱与肾损伤。结论：MHWD通过AMPK/ULK1通路恢复自噬稳态、增强能量代谢及抑制炎症，改善糖尿病前期代谢紊乱并保护肾功能，为早期肾脏保护及潜在临床应用提供机制依据。

论文解读：改良黄连温胆汤通过激活AMPK/ULK1通路恢复自噬并抑制炎症改善糖尿病前期肾损伤

本研究由Zou Xiuqi、Yang Xing、Liu Xinbang、Fan Yanbo、Ding Nian、Zheng Chenghong完成，发表于《International Immunopharmacology》。

一、研究背景与立项依据

糖尿病前期（prediabetes）指空腹血糖受损（impaired fasting glucose, IFG）、糖耐量受损（impaired glucose tolerance, IGT）或二者并存，血糖升高但未达糖尿病诊断阈值。前瞻性队列研究表明，糖尿病前期人群肾小球高滤过风险约为血糖正常者的2倍，尿白蛋白升高风险约1.8倍，估算肾小球滤过率（estimated glomerular filtration rate, eGFR）下降更快，尿微量白蛋白阳性率（12.3% vs 6.5%）更高，提示肾小球与肾小管在糖尿病前期即存在结构与功能损害。肾小管上皮细胞作为滤过屏障重要组分，在高糖与炎症环境下易发生损伤，是早期干预的关键靶点。糖尿病前期病理生理以胰岛素抵抗及β细胞功能减退为主，伴慢性低度炎症，血清TNF-α、IL-6升高可加重胰岛素抵抗及游离脂肪酸释放。自噬（autophagy）与炎症密切相关：自噬可负调控炎症反应，炎症状态亦可影响自噬活性；肥胖及胰岛素抵抗状态下自噬缺陷加速疾病进展。AMP活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase, AMPK）是重要能量感受器，感知AMP/ATP比值变化后磷酸化UNC51样激酶1（UNC51-like kinase 1, ULK1）关键位点Ser⁵⁵⁵与Ser⁷⁷⁷，启动自噬：ULK1激活Beclin1–VPS34复合物促自噬体（autophagosome）形成；ATG5–ATG12–ATG16L1复合物参与自噬体膜延伸；微管相关蛋白1轻链3（microtubule-associated protein 1 light chain 3, LC3）由胞质LC3?I转变为膜结合型LC3?II标志自噬体成熟； sequestosome?1（P62/SQSTM1）结合LC3?II将底物靶向至自噬溶酶体降解。中药强调整体观念与辨证论治，可多靶点改善糖脂代谢、胰岛功能及炎症状态。改良黄连温胆汤（Modified Huanglian Wendan Decoction, MHWD）出自?《六因条辨》，由黄连（Coptidis rhizoma）、白术（Atractylodes rhizoma）、半夏（Pinelliae rhizoma）、陈皮（Citri reticulatae pericarpium）、甘草（Glycyrrhizae radix et rhizoma）、枳实（Aurantii fructus immaturus）、茯苓（Poria）、竹茹（Bambusae caulis in taenias）组成，功效清热祛湿、健脾化痰，现代药理显示所含小檗碱（berberine）、fullegin A、甘草酸（glycyrrhizic acid）、白术内酯（atractylenolide）等有降糖、调脂、抗炎及可能经AMPK激活增强自噬的作用，但MHWD减轻糖尿病前期肾损伤的具体机制不明。本研究假设MHWD通过调节AMPK/ULK1通路抑制高糖诱导的自噬紊乱与炎症，从而缓解糖尿病前期肾损伤。

二、主要技术方法概述

研究人员首先以超高效液相色谱?质谱联用（ultra?performance liquid chromatography–mass spectrometry, UPLC?MS）正负离子模式鉴定MHWD化学成分。采用高脂饮食联合低剂量链脲佐菌素（streptozotocin, STZ）建立Sprague?Dawley大鼠糖尿病前期模型，设对照组、模型组、MHWD各剂量组及二甲双胍（metformin）阳性对照组，检测空腹血糖（fasting blood glucose, FBG）、胰岛素、计算稳态模型评估胰岛素抵抗指数（homeostatic model assessment of insulin resistance, HOMA?IR）、血脂四项、体重，并取肾组织行HE、Masson染色评估肾损伤。对肾组织行转录组测序（RNA?seq）与串联质谱标签（tandem mass tag, TMT）定量蛋白质组学分析筛选差异基因与蛋白并进行富集分析。体外以人近端肾小管上皮细胞系（human kidney?2, HK?2）给予高糖处理，分别加用MHWD含药血清、二甲双胍、自噬抑制剂氯喹（chloroquine, CQ）及AMPK特异性抑制剂Compound C预处理，检测细胞活力、自噬标志物LC3?II/LC3?I、P62、磷酸化AMPK（p?AMPK^Thr172）、磷酸化ULK1（p?ULK1^Ser555、p?ULK1^Ser777）及炎性因子TNF?α、IL?6；透射电镜观察自噬体数量，免疫荧光检测LC3斑点；部分实验以二甲双胍为阳性对照。所有动物实验经湖北中医药大学伦理委员会批准（HUCMS00311705, HUCMS00311091）。

三、研究结果

UPLC?MS analysis of MHWD reveals its major chemical components and bioactive compounds

UPLC?MS正、负离子模式分析鉴定MHWD中含黄酮类、生物碱类、萜类、苷类及酚酸类等成分，明确15种主要化合物，为后续药效物质基础研究提供依据。

MHWD alleviates metabolic disorders and renal injury in prediabetic rats

研究人员发现MHWD干预可显著降低糖尿病前期模型大鼠空腹血糖、HOMA?IR、总胆固醇（total cholesterol, TC）、甘油三酯（triglyceride, TG）、低密度脂蛋白胆固醇（low?density lipoprotein cholesterol, LDL?C），升高高密度脂蛋白胆固醇（high?density lipoprotein cholesterol, HDL?C），抑制异常体重增长；肾组织病理显示MHWD减轻肾小球系膜增生、肾小管空泡变性及间质胶原沉积，降低尿微量白蛋白/肌酐比值（urinary microalbumin?to?creatinine ratio, UACR）与血清肌酐（serum creatinine, Scr），提示MHWD改善全身代谢紊乱并减轻早期肾损伤。

Transcriptomic and proteomic analyses indicate MHWD acts via metabolic regulation, autophagy restoration and anti?inflammation

肾组织RNA?seq与TMT蛋白组学显示，差异表达基因与蛋白主要富集于糖脂代谢、AMPK信号通路、自噬及NF?κB（nuclear factor kappa?light?chain?enhancer of activated B cells, NF?κB）炎症通路；MHWD使代谢相关分子趋于正常，上调自噬相关分子表达，下调TNF?α、IL?6、IL?1β等炎性因子表达，提示核心机制涉及代谢调节、恢复自噬及抑制炎症。

MHWD restores renal autophagy and suppresses inflammation via the AMPK/ULK1 pathway in vivo

Western blot显示模型组p?AMPK^Thr172、p?ULK1^Ser555、p?ULK1^Ser777及LC3?II/LC3?I比值下降，P62蓄积；MHWD干预后上述磷酸化水平及LC3?II/LC3?I回升，P62减少。透射电镜见MHWD增加肾小管上皮细胞内自噬体数目，免疫荧光显示LC3斑点增多。同期肾组织及血清TNF?α、IL?6降低。此效应与二甲双胍相当，表明MHWD在体通过AMPK/ULK1轴恢复肾脏自噬并抑制炎症。

MHWD exerts AMPK/ULK1?dependent autophagic and anti?inflammatory effects in high?glucose?exposed HK?2 cells

高糖处理的HK?2细胞中p?AMPK、p?ULK1、LC3?II下调，P62及TNF?α、IL?6上调；MHWD含药血清可逆转上述改变且与二甲双胍效果相似。加入自噬晚期抑制剂氯喹后LC3?II进一步累积但P62降解被阻断，MHWD抗炎效应减弱；加入AMPK抑制剂Compound C后，MHWD引起的AMPK/ULK1磷酸化、自噬流恢复及炎症因子下调均被取消，证实MHWD对肾小管上皮细胞的自噬恢复及抗炎保护作用依赖于AMPK/ULK1通路。

四、讨论与结论翻译

讨论部分指出，本研究首次证实MHWD改善糖尿病前期大鼠糖脂代谢紊乱并减轻早期肾损伤，机制上通过激活AMPK使其磷酸化并进而磷酸化ULK1（Ser⁵⁵⁵、Ser⁷⁷⁷），启动自噬起始，促进自噬体形成与底物（如P62）清除，恢复自噬稳态，抑制NF?κB等介导的炎症级联反应，从而拮抗高糖环境下的肾小管上皮细胞损伤。氯喹阻断自噬溶酶体降解可削弱MHWD抗炎作用，Compound C阻断AMPK则取消MHWD对ULK1及自噬的调控，进一步锁定AMPK/ULK1?依赖的自噬激活为核心机制。研究揭示了MHWD多靶点干预糖尿病前期肾损伤的科学内涵，为临床早期应用中医药保护肾功能提供了实验依据。

结论（翻译）：综上所述，本研究表明改良黄连温胆汤（MHWD）通过恢复代谢稳态、增强自噬及减轻炎症来保护糖尿病前期肾损伤。在机制上，MHWD激活AMPK/ULK1通路，促进自噬起始并使自噬底物得以清除；抑制自噬或AMPK可削弱其效应。这些发现揭示了MHWD的多靶点作用机制，并强调通过AMPK/ULK1轴恢复自噬是减轻糖尿病前期肾损伤的关键环节，为早期肾脏保护干预及潜在临床应用提供了理论基础。