羟基红花黄素A通过抑制Calpain-1/HIF-1α途径，增强肺微血管内皮屏障功能，从而减轻脂多糖诱导的急性肺损伤

《International Immunopharmacology》：Hydroxysafflor yellow A mitigates lipopolysaccharide-induced acute lung injury by enhancing pulmonary microvascular endothelial barrier function via Calpain-1/HIF-1α inhibition

　　

刘涛|黄一豪|李源|李新秋|苏子轩|王一恒

中南大学衡阳医学院附属第一医院麻醉科，中国湖南省衡阳市421001

摘要

目的

肺微血管内皮细胞（PMEC）屏障功能障碍是急性肺损伤（ALI）的关键病理特征。红花的主要活性成分羟基红花黄素A（HSYA）具有潜在的肺损伤保护作用。本研究旨在探讨HSYA是否通过抑制Calpain-1/缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）通路来维持LPS诱导的ALI中的PMEC屏障完整性。

方法

在体内实验中，LPS诱导的ALI小鼠预先接受HSYA或Calpain-1过表达慢病毒处理。在体外实验中，LPS刺激的PMEC分别用HSYA、Calpain-1 siRNA或HIF-1α过表达质粒处理。通过组织染色、湿/干比值、流式细胞术、跨内皮电阻（TEER）、ELISA、RT-qPCR、Western blotting和免疫荧光等方法评估肺损伤、细胞凋亡、内皮屏障完整性和相关分子表达。此外，还通过分子对接和表面等离子体共振（SPR）分析了HSYA与蛋白质的直接相互作用。

结果

HSYA显著减轻了LPS诱导的肺损伤、炎症反应和氧化应激以及体内微血管内皮屏障功能障碍，同时降低了体外PMEC的凋亡并恢复了屏障完整性。分子对接和SPR分析证实HSYA以高亲和力直接结合Calpain-1，从而抑制其活性并下调HIF-1α的表达。进一步研究表明，沉默Calpain-1可提供对LPS诱导的PMEC损伤的保护作用，而HIF-1α过表达部分抵消了这些保护效果。此外，Calpain-1过表达部分逆转了HSYA对PMEC屏障功能障碍和ALI的保护作用。

**结论**：HSYA通过直接抑制Calpain-1/HIF-1α通路来维持肺微血管屏障功能，从而缓解LPS诱导的ALI。

引言

急性肺损伤（ALI）是一种危及生命的呼吸系统综合征，死亡率很高，通常由严重的炎症反应引发[1] [2]。宿主对过度激活的炎症介质的反应失调会导致正反馈循环不断加剧，从而加重肺损伤，并可能发展为急性呼吸窘迫综合征[3]。如果不及时识别并采取早期针对性干预，ALI会迅速进展为严重的呼吸衰竭[4]。脂多糖（LPS）是ALI的关键致病因素，会引发炎症级联反应，导致上皮细胞坏死和凋亡[5]。特别是肺微血管内皮细胞（PMEC）的凋亡是LPS诱导的ALI的核心驱动因素，会破坏内皮屏障完整性，增加通透性，并促进富含蛋白质的液体渗入肺泡空间[6] [7]。先前的研究表明，减少PMEC凋亡和恢复血管通透性可以有效减轻LPS诱导的ALI[8]。因此，直接保护肺微血管内皮功能的疗法是缓解LPS诱导的ALI的关键且具有临床应用价值的策略。

羟基红花黄素A（HSYA）是红花（Carthamus tinctorius L.）的主要生物活性成分之一，已被证明可以减轻脑缺血-再灌注损伤期间的炎症反应[9]。大量啮齿动物研究表明，HSYA具有显著的抗血小板、抗炎和抗氧化作用，从而在心肌缺血-再灌注损伤模型中提供心脏保护[10] [11] [12] [13] [14]。此外，HSYA通过蛋白激酶A（PKA）减轻油酸诱导的ALI[15]，并通过调节Toll样受体4通路缓解LPS诱导的ALI[16]。这些发现表明HSYA是预防和治疗ALI的有希望的治疗候选物。然而，HSYA在LPS诱导的ALI中的确切调控机制仍有待进一步阐明。

Calpain是一类保守的钙依赖性半胱氨酸蛋白酶家族，在多种细胞类型中广泛表达[17] [18]。Calpain调节多种细胞过程，包括细胞黏附、迁移、炎症、增殖和血管生成。相反，遗传或药物抑制Calpain-1/2可减少炎症细胞因子的表达，并在伤口愈合过程中降低CD31⁺血管密度[19]。炎症信号传导和氧化应激是ALI的关键驱动因素[15]，Calpain-1通过促进炎症细胞迁移和加速促炎细胞因子的释放与炎症反应密切相关[20]。最近的研究表明，在热应激条件下抑制Calpain-1可以防止LPS诱导的PMEC凋亡[21]，表明Calpain-1是受损肺中内皮细胞死亡的上游调节因子。缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）是缺氧反应中的关键转录因子，可上调血管内皮生长因子（VEGF）的表达[22]。VEGF是最强的血管通透性调节因子之一，可通过下调紧密连接蛋白（如血管内皮-钙黏蛋白（VE-cadherin）[23] [24]来破坏内皮屏障完整性。在败血症及相关情况下，HIF-1α-VEGF轴的激活会加重肺水肿和炎症[25]。相反，抑制这一通路可以减轻PMEC屏障功能障碍并缓解ALI[25]。此外，Calpain-1的激活会提高HIF-1α的表达水平，而同时抑制Calpain-1和HIF-1α可以减轻内皮损伤[26]。然而，Calpain-1与HIF-1α在ALI背景下的相互作用仍不完全清楚。

基于这些发现，我们假设Calpain-1/HIF-1α通路可能参与PMEC屏障功能的调节和LPS诱导的ALI的进展。然而，HSYA是否通过调节Calpain-1/HIF-1α通路影响肺微血管内皮屏障功能和LPS诱导的ALI仍不清楚。本研究旨在证明HSYA通过抑制Calpain-1/HIF-1α通路来维持内皮屏障完整性，从而缓解LPS诱导的ALI，为LPS诱导的ALI的发病机制提供新的见解，并确定有希望的治疗靶点。

章节摘录

伦理声明

本研究中的所有动物实验均遵循美国国立卫生研究院的实验室动物使用指南，并获得了中南大学动物护理和使用委员会的批准（中国湖南）。我们严格遵守批准的方案，强调减少动物使用并减轻它们的痛苦。

动物

从南岳生物医药有限公司购买了特定的无特定病原体的雄性C57BL/6 J小鼠（6–8周龄，体重18–21克）。

HSYA可减轻LPS诱导的ALI小鼠的炎症反应和氧化应激

我们首先通过腹腔注射LPS建立了ALI小鼠模型。与健康对照组相比，LPS处理的小鼠肺湿/干（W/D）比值显著增加（图1A），并且肺损伤严重，表现为肺泡结构破坏、隔膜增厚以及广泛的炎症浸润和出血性渗出（图1B）。此外，ALI小鼠的支气管肺泡灌洗液（BALF）中的促炎标志物（MPO、TNF-α和IL-1β）水平显著升高

讨论

在本研究中，我们首次证明天然生物活性化合物HSYA通过抑制Calpain-1/HIF-1α信号通路来维持肺微血管屏障完整性，从而缓解LPS诱导的ALI。我们的体内和体外数据表明，HSYA显著减轻了肺损伤、炎症反应和氧化应激，同时保护PMEC免于凋亡和紧密连接的降解。此外，通过结合计算对接

患者发表同意书

不适用。

CRediT作者贡献声明

刘涛：撰写——初稿、可视化、资源准备、实验设计、数据分析、概念化。黄一豪：撰写——初稿、软件使用、资源准备、方法学设计、资金获取、数据管理。李源：撰写——初稿、项目监督、实验设计、资金获取。李新秋：数据验证、软件使用、项目监督。苏子轩：数据验证、项目监督。

伦理声明

本研究中的所有动物实验均遵循美国国立卫生研究院的实验室动物使用指南，并获得了中南大学动物护理和使用委员会的批准（中国湖南）。我们严格遵守批准的方案，强调减少动物使用并减轻它们的痛苦。

伦理批准和参与同意

本研究符合美国国立卫生研究院的实验室动物使用指南。获得了中南大学动物护理和使用委员会的批准。

资助

本研究得到了湖南省自然科学基金（2024JJ5354&2020JJ5509）、湖南省卫生健康委员会科学研究项目（202104110007）和湖南省教育科学研究项目（21C0300）的资助。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文报告工作的财务利益或个人关系。

致谢

不适用。