中和牙本质涎磷蛋白通过阻断肿瘤细胞与内皮细胞间的相互作用促进结直肠癌肿瘤血管正常化

《Acta Pharmaceutica Sinica B》：Neutralizing dentin sialophosphoprotein facilitates tumor vascular normalization in colorectal cancer by blocking the crosstalk between tumor cells and endothelial cells

　　

肿瘤血管的不规则、弯曲和不均匀形状导致恶性微环境，促进转移。在这项研究中，利用患者来源的异种移植模型，研究人员观察到，与非转移性结直肠癌（CRC）组织来源的肿瘤相比，转移性结直肠癌（CRC）组织来源的肿瘤表现出更高的血管密度、缺氧和通透性，但灌注和周细胞覆盖减少。研究人员进行了高通量微阵列分析，以确定血管结构受损的分子机制。牙本质涎磷蛋白（DSPP）被鉴定为在具有异常血管的转移性CRC中上调最显著的基因。临床上，高DSPP表达与不良预后和晚期CRC分期密切相关。DSPP在体内刺激肿瘤血管异常化和CRC转移，并作为α_vβ₃整合素（α_vβ₃）的新型配体发挥作用，该整合素在肿瘤血管中主要表达。DSPP可直接结合内皮细胞细胞膜上α_vβ₃的肽段（氨基酸368-411），激活丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路。随后，研究人员研究了通过人DSPP抗体或α_vβ₃选择性抑制剂TFA靶向DSPP的治疗方法，发现其能有效诱导小鼠肿瘤血管正常化并抑制肿瘤转移。此外，白细胞介素-17F（IL-17F）被鉴定为DSPP表达的上游调节因子，通过p65结合其启动子促进DSPP转录。因此，靶向DSPP/α_vβ₃轴以促进肿瘤血管正常化和抑制肿瘤转移，代表了晚期CRC患者联合靶向治疗临床实施的新策略。

## 论文解读：牙本质涎磷蛋白（DSPP）阻断肿瘤细胞与内皮细胞相互作用促进结直肠癌肿瘤血管正常化

### 研究背景与目的

结直肠癌（CRC）是全球第三大常见癌症，转移是导致死亡的主要原因。肿瘤血管常呈现结构性和功能性异常，如形状不规则、弯曲、通透性高、周细胞覆盖减少，这些特征促进恶性微环境并驱动转移。尽管抗血管内皮生长因子（VEGF）治疗在CRC中取得一定疗效，但肿瘤血管正常化（TVN）策略——通过恢复血管结构和功能而非单纯抑制血管生成——被认为能改善化疗和免疫治疗效果。然而，TVN的分子机制尚不明确。牙本质涎磷蛋白（DSPP）属于小整合素结合配体N-连接糖蛋白（SIBLINGs）家族，已知在骨形成和多种肿瘤中发挥作用，但其在CRC血管异常中的角色未被阐明。本研究旨在探索CRC细胞分泌的DSPP如何通过影响肿瘤血管异常化促进转移，并评估靶向DSPP/α_vβ₃整合素轴作为TVN新策略的可能性。该论文发表在《Acta Pharmaceutica Sinica B》。

### 主要技术方法

研究人员使用了患者来源的异种移植模型（PDX）和患者来源肿瘤类器官（PDTO）构建体内外模型；通过高通量微阵列分析筛选差异表达基因；利用免疫共沉淀（Co-IP）、谷胱甘肽巯基转移酶（GST）pull-down实验和表面等离子共振（SPR）技术验证蛋白-蛋白直接结合；采用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除或过表达目标基因；运用染色质免疫沉淀（ChIP）和双荧光素酶报告基因实验解析转录调控机制；并在原位移植裸鼠模型中评估肿瘤血管形态、功能及转移。临床样本队列来源为南方医院174例CRC患者组织（2010-2021年）及血清样本。

### 研究结果

**3.1 血管形态与靶基因筛选**：通过比较临床转移性CRC（mCRC）与非转移性CRC（nmCRC）组织及PDX模型，研究人员发现mCRC原发肿瘤血管密度更高、扭曲更多、周细胞覆盖不足；PDX-mCRC肿瘤表现出血管密度增加、缺氧、高通透性及低灌注。高通量微阵列分析结合PDX验证，筛选出DSPP为在异常血管的mCRC中上调最显著的基因，且其在SIBLINGs家族中表达差异最大。

**3.2 CRC细胞分泌的DSPP诱导肿瘤血管异常和转移**：在HCT116和SW620细胞中敲低DSPP后，条件培养基（CM）抑制人脐静脉内皮细胞（HUVEC）管形成和鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）血管生成。原位移植裸鼠模型中，DSPP敲低组肿瘤血管密度、通透性和缺氧降低，灌注和周细胞覆盖增加，扫描电镜显示内皮单层规则光滑；同时原发肿瘤缩小，肝脾转移灶减少，总生存期延长。

**3.3 抑制DSPP分泌减少血管生成、血管异常和CRC转移**：在HCT8和Caco-2细胞中过表达DSPP，CM显著增强HUVEC管形成和CAM血管生成，并可被抗DSPP抗体（α-DSPP）抑制。原位移植模型中，DSPP过表达导致血管密度、通透性和缺氧增加，灌注和周细胞覆盖降低，电镜显示内皮层不规则紊乱；原发肿瘤增大且转移加重，生存期缩短。

**3.4 DSPP直接与整合素α_vβ₃相互作用**：通过免疫沉淀和液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS），鉴定出整合素α_vβ₃为DSPP结合蛋白。GST pull-down和SPR实验证实DSPP能直接结合ITGAV（1-438氨基酸）和ITGB3（109-352氨基酸）的胞外肽段。分子对接模型显示裂解后的牙本质磷蛋白（DPP）中的RGD序列介导结合。过表达DPP（而非牙本质涎蛋白DSP）的CRC细胞CM显著促进管形成和CAM血管生成，并被RGD环肽抑制剂Cyclo(-RGDfK)逆转。在PDTOs中同样验证了DPP的促血管作用。

**3.5 DSPP/α_vβ₃/MAPK信号轴促进肿瘤血管异常化**：KEGG和WiKi富集分析揭示DSPP参与调节肿瘤血管；基因集富集分析（GSEA）显示MAPK通路在DSPP高表达组织中富集。DSPP过表达CRC细胞的CM增加HUVEC中p-ERK表达，被Cyclo(-RGDfK)和α-DSPP减弱。MAPK激酶抑制剂Selumetinib（AZD6244）可完全抑制DSPP诱导的管形成，并逆转血管生成和基质金属蛋白酶相关基因的上调。

**3.6 白细胞介素-17F（IL-17F）上调DSPP表达并诱导CRC血管异常**：在HCT8细胞中，IL-17F（而非IL-17A）显著上调DSPP mRNA和蛋白水平。IL-17F通过受体IL-17RA/IL-17RC激活NF-κB信号，ChIP和荧光素酶实验证实p65直接结合DSPP启动子区域。体内原位移植模型中，IL-17F促进肿瘤生长、肝转移和血管异常，而α-DSPP或Cyclo(-RGDfK)可逆转这些效应。

**3.7 DSPP在CRC中上调并与不良预后相关**：临床组织样本显示，mCRC中DSPP表达显著高于nmCRC，血清DSPP水平也与转移正相关。高DSPP表达与淋巴结转移、晚期Duke分期及较差总生存率相关。多重免疫荧光（mIF）和免疫组化（IHC）证实高DSPP肿瘤中扭曲血管增多，且DSPP表达与IL-17F、p-p65、CD31、ITGAV、ITGB3水平正相关。

### 讨论与结论

讨论部分指出，TVN策略通过恢复血管功能改善抗肿瘤治疗效果，但具体机制仍待阐明。本研究首次揭示DSPP作为SIBLINGs成员，其裂解产物DPP直接结合内皮细胞上高表达的整合素α_vβ₃，通过激活FAK-MAPK信号通路驱动血管异常化，而炎症因子IL-17F通过NF-κB途径上调DSPP表达。与传统靶向内皮细胞的TVN策略不同，本研究发现肿瘤细胞分泌的DSPP是血管异常的关键旁分泌因子，靶向DSPP/α_vβ₃轴可诱导TVN并抑制转移。

研究结论：本研究强调了CRC中血管异常与转移之间的密切关系。研究人员将DSPP鉴定为肿瘤血管功能障碍和转移的关键介质，突出其为潜在治疗靶点。机制上，在炎症性肿瘤微环境中，IL-17F上调CRC细胞中DSPP表达和分泌；随后分泌的DSPP通过结合内皮细胞表面整合素α_vβ₃激活下游FAK-MAPK信号，从而促进肿瘤血管异常化和转移。总体而言，本研究提供了有力证据，表明DSPP是TVN和转移的新型预测生物标志物，为CRC治疗干预提供了有前景的途径。