新型环状RNA circUnc79 通过 miR-149-3p/EAAT2 轴及谷氨酸能可塑性调控吗啡诱导的奖赏记忆

《Acta Pharmaceutica Sinica B》：Novel circUnc79 regulates morphine-induced reward memory via the miR-149-3p/EAAT2 axis and glutamatergic plasticity

　　

阿片成瘾由适应不良的奖赏记忆驱动，但其分子基础仍知之甚少。环状RNA（circRNAs）已成为神经可塑性的关键调控因子，但其在成瘾相关记忆中的作用仍不明确。研究人员在此鉴定出 circUnc79——一种神经元富集且定位于突触的 circRNA——其为内侧前额叶皮层（medial prefrontal cortex，mPFC）中吗啡奖赏记忆的关键调节因子。在吗啡诱导的条件性位置偏爱（conditioned place preference，CPP）模型中，circUnc79 的表达在线索诱导的记忆提取期间呈动态下调。功能获得与功能缺失实验表明，circUnc79 可双向调控吗啡奖赏记忆的获得与持续，而不影响运动能力、焦虑样行为、社会互动或蔗糖奖赏。机制上，circUnc79 作为 miR-149-3p 的竞争性内源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA），从而解除其对兴奋性氨基酸转运体2（excitatory amino acid transporter 2，EAAT2；由 Slc1a2 编码）的抑制。升高的神经元 EAAT2 增强突触前谷氨酸再摄取与循环利用，从而支持奖赏记忆编码。对 miR-149-3p 的操控产生相反的行为学与突触效应，支持了该调控轴的功能相关性。上述发现揭示了调控阿片类奖赏记忆基础突触可塑性的 circUnc79/miR-149-3p/EAAT2 通路，并强调 circUnc79 可作为阿片类使用障碍的潜在治疗靶点。

该研究发表于《Acta Pharmaceutica Sinica B》，聚焦阿片类使用障碍（opioid use disorder，OUD）中最核心但长期难以干预的病理环节之一，即药物相关奖赏记忆的形成、维持与提取。阿片成瘾的复吸并不仅仅由药理依赖驱动，更与环境线索重新激活药物记忆密切相关。内侧前额叶皮层（mPFC）是奖赏加工、执行控制与情境联结的重要脑区，其内发生的突触重塑和神经兴奋性改变被认为是成瘾记忆持续化的重要基础。然而，既往研究主要集中于蛋白编码基因、受体信号和表观遗传调控，对非编码RNA尤其是环状RNA（circRNA）在阿片类奖赏记忆提取阶段中的功能认识仍十分有限。与此同时，谷氨酸稳态失衡被视为成瘾神经生物学的共同特征，但神经元来源的兴奋性氨基酸转运体2（EAAT2）是否受 circRNA 调控、并进一步影响奖赏记忆相关可塑性，尚缺乏直接证据。正是在这一背景下，研究人员围绕前期转录组线索，系统考察了 circUnc79 在吗啡奖赏记忆中的作用及其分子机制。

研究人员首先基于吗啡诱导的条件性位置偏爱（CPP）模型，结合转录组测序、分子验证、脑区特异性病毒操控、行为学评估、形态学分析、超微结构观察、纤维光度记录以及突触体蛋白检测等多层级手段，建立了从分子到环路再到行为的整合研究框架。研究结果表明，circUnc79 是一种来源于 Unc79 基因、富集于 mPFC 神经元并偏向突触前定位的 circRNA。在吗啡奖赏记忆提取时，circUnc79 显著下调；其过表达增强吗啡奖赏记忆并削弱消退，而其敲低则减弱奖赏记忆获得与提取，促进消退并抑制吗啡诱发的复燃。机制上，circUnc79 通过充当 miR-149-3p 的 ceRNA，解除 miR-149-3p 对 Slc1a2/EAAT2 的抑制，维持突触前谷氨酸再摄取和循环，进而支撑吗啡相关记忆所需的神经元高兴奋性与突触可塑性。该研究的重要意义在于，将 circRNA、miRNA 与谷氨酸转运稳态有机连接起来，提出了一个解释阿片类奖赏记忆维持的新型转录后调控框架，并为 OUD 干预提供了具有回路特异性和分子针对性的潜在靶点。

在技术方法方面，作者主要采用以下几类关键策略：其一，利用雄性 C57BL/6J 小鼠建立吗啡 CPP 及提取模型，并辅以开放场、高架十字迷宫、三箱社交、蔗糖偏好等行为学检测评价特异性；其二，基于 mPFC 组织 RNA-seq 与 ONT-seq 数据筛选候选分子，并通过 RT-qPCR、RNase R 消化、Actinomycin D 转录抑制、Sanger 测序和 BaseScope 原位杂交验证 circUnc79 的环状结构、稳定性与定位；其三，采用慢病毒（LV）和腺相关病毒（AAV）在 mPFC 内进行 circUnc79 或 miR-149-3p 的过表达/敲低；其四，运用双荧光素酶、AGO2-RIP、细胞转染验证 ceRNA 作用；其五，结合 Golgi 染色、透射电镜（TEM）、纤维光度法及突触体分离解析突触结构与功能变化。

在研究结果部分，论文围绕多个层层递进的小标题展开，证据链完整且逻辑清晰。

3.1. CircUnc79 in the mPFC mediated cue-associated morphine reward memory
研究人员首先建立稳定的吗啡 CPP 模型，并在记忆提取时点取 mPFC 进行转录组分析，鉴定出差异表达的 circUnc79。通过发散引物扩增、Sanger 测序以及 RNase R 和 Actinomycin D 实验，证实 circUnc79 具有典型 circRNA 的回剪接结构与高稳定性。进一步 qPCR 和 BaseScope 结果显示，circUnc79 在吗啡 CPP 后于 mPFC 中显著下调，而线性 Unc79 mRNA 不变；该变化具有脑区特异性与记忆情境依赖性，不是单纯药理刺激所致。共定位分析表明，circUnc79 主要富集于神经元，尤其偏向兴奋性谷氨酸能神经元，并以突触前分布为主。由此得出结论：circUnc79 是与吗啡线索相关奖赏记忆密切相关的、神经元富集的突触 circRNA。

3.2. Bidirectional modulation of morphine reward memory by circUnc79 in the mPFC
为了明确功能，研究人员在 mPFC 中上调或敲低 circUnc79。行为学结果显示，circUnc79 过表达显著增强吗啡诱导的 CPP，并使消退学习受损；相反，神经元特异性敲低 circUnc79 则显著减弱吗啡偏爱，在获得期与提取期均降低 CPP 评分，同时促进消退并阻止吗啡诱导的复燃。重要的是，这种效应并不伴随运动、焦虑、空间记忆、社交认知或天然奖赏的明显改变，说明其作用具有较强行为特异性。蛋白检测进一步发现，吗啡处理提升了 PSD95、VGLUT1 和 synaptophysin（SYP）等突触相关蛋白，而 circUnc79 敲低能够将其恢复至接近基线水平。该部分说明 circUnc79 是吗啡奖赏记忆的重要正向调控因子，其作用与突触可塑性相关。

3.3. CircUnc79 knockdown reversed morphine-induced synaptic remodeling
在形态学层面，Golgi 染色显示吗啡条件化导致 mPFC 神经元树突分支长度增加、Sholl 交点数增多，提示树突复杂度增强；同时，总棘密度升高，成熟蘑菇样棘增加而薄棘减少，反映出更稳定、强化的突触连接状态。circUnc79 敲低能够逆转上述变化，使树突与棘形态向对照水平回归。透射电镜进一步显示，吗啡记忆提取伴随突触前囊泡密度增加、突触后致密物（postsynaptic density，PSD）增厚以及突触间隙变窄，而 circUnc79 敲低均可明显纠正这些超微结构改变。由此可见，circUnc79 参与协调吗啡奖赏记忆相关的突触前与突触后重塑。

3.4. CircUnc79 knockdown reversed morphine-induced neuronal hyperexcitability
研究人员进一步利用纤维光度法监测 mPFC 神经元 Ca²⁺ 活动。结果表明，吗啡条件化小鼠在进入药物配对隔室时，神经元 Ca²⁺ 瞬变振幅显著升高，事件频率增加而持续时间缩短，提示记忆提取伴随情境依赖性的神经元高兴奋状态。circUnc79 敲低显著削弱这一高兴奋性，并使激活模式更接近生理对照。该结果从环路活动层面证明，circUnc79 是维持吗啡相关情境反应性兴奋的重要分子基础。

3.5. Multimodal validation of the circUnc79/miR-149-3p/EAAT2 ceRNA regulatory axis
在机制探索中，作者整合 RNA-seq、ONT-seq 与生物信息预测，锁定同时与 circUnc79 和 EAAT2 相关联的 miR-149-3p。体内结果显示，吗啡条件化后 miR-149-3p 上调，而 EAAT2 下调，符合 ceRNA 轴的经典表达模式。细胞实验发现，circUnc79 过表达降低 miR-149-3p 并提升 Slc1a2/EAAT2 的 mRNA 与蛋白表达，敲低则产生相反结果；miR-149-3p 模拟物抑制 Slc1a2，抑制剂则上调 Slc1a2。AGO2 共定位、AGO2-RIP 与双荧光素酶实验共同证明 circUnc79 可直接“海绵化”miR-149-3p，并解除其对 EAAT2 的抑制。该部分建立了 circUnc79/miR-149-3p/EAAT2 这一核心分子通路。

3.6. miR-149-3p as a functional mediator of circUnc79-dependent morphine reward memory
为验证 miR-149-3p 的功能地位，研究人员在 mPFC 内分别上调和敲低 miR-149-3p。结果显示，AgomiR-149-3p 可显著削弱吗啡奖赏记忆的获得与提取，降低 CPP 评分；而神经元特异性敲低 miR-149-3p 则增强吗啡偏爱。更关键的是，在 circUnc79 敲低背景下同时敲低 miR-149-3p，能够挽救前者导致的 CPP 抑制效应。该结果提示 miR-149-3p 是 circUnc79 调控奖赏记忆的关键功能介质，二者之间存在明确的层级调控关系。

3.7. The circUnc79/miR-149-3p/EAAT2 axis regulates morphine reward memory via neuronal excitability and glutamatergic homeostasis
在功能终末验证中，作者一方面用 jGCaMP7f 记录神经元 Ca²⁺ 动态，发现 miR-149-3p 敲低进一步增强吗啡背景下的神经元高兴奋；另一方面使用 iGluSnFR3.v857 监测谷氨酸信号，结果表明吗啡条件化增加 mPFC 谷氨酸释放，而 miR-149-3p 敲低可进一步放大这一释放，尤其限于药物配对情境。突触体分离和 Western blot 显示，吗啡降低了突触体中的 EAAT2，circUnc79 敲低使这一降低更加明显，同时使 PSD95、VGLUT1 和 SYP 等改变向基线回调；而 miR-149-3p 敲低则可恢复 EAAT2，并影响 VGLUT1 水平。双重敲低实验进一步证实，miR-149-3p 是 circUnc79 调节 EAAT2 与谷氨酸稳态的关键执行因子。综上，circUnc79 通过 miR-149-3p/EAAT2 轴调控突触前谷氨酸再摄取与装载，进而影响神经元兴奋性和奖赏记忆表达。

讨论部分总体上围绕三个层面展开。首先，论文强调 circUnc79 作为一种稳定、进化保守、神经元富集并偏向突触前定位的 circRNA，在吗啡奖赏记忆中具有明确的区域与时相特异性。它只在 mPFC 且在条件化相关记忆情境下发生变化，提示其不是一般性的阿片药理反应分子，而是与病理性记忆痕迹更直接相关。其次，作者将 circUnc79 置于 ceRNA 网络中加以解释，指出其通过结合 miR-149-3p、解除对 EAAT2 的抑制而影响谷氨酸稳态，这一机制把非编码 RNA 调控与突触谷氨酸转运联系起来。再次，讨论进一步结合树突棘重塑、突触超微结构、Ca²⁺ 活动和谷氨酸释放变化，提出 circUnc79 实际上协调了从分子、突触到局部环路的多尺度可塑性变化，从而支撑药物相关记忆的编码、提取与持续。论文同时指出，该通路的改变不明显影响天然奖赏和一般情绪样行为，提示其在成瘾相关可塑性中的相对特异性。整体而言，研究不仅拓展了 OUD 的分子病理图谱，也为基于 circRNA 或谷氨酸稳态调控的精准干预提供了实验依据。

研究结论部分可译为：
总之，研究人员鉴定出 circUnc79 是一种神经元富集的调节因子，其通过 circUnc79/miR-149-3p/EAAT2 轴协调吗啡诱导的突触重塑。circUnc79 通过整合突触前谷氨酸循环利用与突触后结构可塑性，将非编码 RNA 生物学与成瘾相关神经适应性联系起来。总体而言，上述发现表明 circUnc79 是阿片奖赏的重要表观遗传介质，并可作为阿片类使用障碍的潜在治疗靶点。