基于质谱技术的抗阿尔茨海默病药物仑卡奈单抗（Lecanemab）表征

《ACS Omega》：Characterization of the Anti-Alzheimer Drug Lecanemab by Mass Spectrometry

　　

仑卡奈单抗（Lecanemab)是一种人源化小鼠单克隆抗体，通过结合淀粉样蛋白寡聚体、原纤维及不可溶性纤维以清除脑内Aβ（amyloid β，淀粉样蛋白β）聚集体，目前已获临床批准用于治疗阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）。尽管具有治疗效果，仑卡奈单抗仍存在副作用，且由于杂质和修饰的存在，不同批次间质量可能存在差异。研究人员采用液相色谱-质谱联用技术对仑卡奈单抗进行了蛋白质组学、完整蛋白及N-糖蛋白质组学分析。研究发现该药物纯度较高，但在色谱图中呈现两个主要峰，且质谱扫描下可见多种分子量接近150 kDa的物种。在重链N304位点鉴定到40种N-糖链。MSFragger进一步分析发现了其他修饰及额外糖基化位点。这些研究结果为仑卡奈单抗关键质量属性的鉴定提供了数据资源，有助于研究其治疗有效性、副作用及可能的批次间质量差异。

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）是一种与衰老相关的不可逆神经退行性疾病，以脑组织中的淀粉样蛋白（amyloid）沉积和神经纤维缠结为主要病理特征。淀粉样蛋白聚集体主要由淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein, APP）经切割产生的Aβ（amyloid β）肽组成，这些肽段具有易聚集性且部分具有神经毒性。APP切割过程的失调及Aβ肽的累积被认为是AD发病的关键始动事件。因此，及时清除脑内过量Aβ被认为是控制这一毁灭性疾病的最高效方式，尤其在神经元大规模死亡和痴呆发生之前的疾病早期阶段。

仑卡奈单抗（Lecanemab, BAN2401）是一种人源化IgG1单克隆抗体，通过结合可溶性Aβ寡聚体、原纤维和不可溶性纤维以清除脑内Aβ聚集体，目前已获批用于AD临床治疗。该抗体于2006年最初以小鼠mAb158（IgG2a）形式开发，以Aβ42^Arc原纤维为免疫原；其人源化版本仑卡奈单抗于2023年1月获美国FDA加速批准（商品名Leqembi），并于半年后转为正式批准。与第一代抗Aβ单克隆抗体（如bapineuzumab、solanezumab和crenezumab）靶向Aβ42单体或老年斑且仅显示Aβ清除证据或适度临床疗效不同，第二代抗Aβ单克隆抗体（包括仑卡奈单抗、aducanumab和gantenerumab）对可溶性Aβ寡聚体具有更高的选择性。仑卡奈单抗偏好于可溶性Aβ原纤维（大寡聚体），可在AD早期阶段减少淀粉样蛋白沉积并适度减缓认知功能下降，但伴有不可忽视的不良事件。

单克隆抗体的理化性质决定其治疗效力及其他生物学活性，包括纯度、残留工艺杂质、氨基酸序列、大小、电荷、高级结构、糖基化及其他翻译后修饰（post-translational modifications, PTMs）。在生产及储存过程中，大小、电荷、氧化及其他化学反应等多种形式的异质性亦可产生，导致批次间产品不一致性。因此，研究人员采用基于质谱的技术对仑卡奈单抗的纯度、分子大小、糖基化及其他可能的蛋白修饰进行了系统分析。

**主要技术方法**

研究样品为购自中国南京药店的仑卡奈单抗注射液（商品名Leqembi，批号8080900，Biogen US Corporation生产）。主要技术方法包括：（1）SDS-PAGE与蛋白质免疫印迹（Western blot）分析蛋白纯度；（2）液相色谱-串联质谱（LC–MS/MS）蛋白质组学分析，采用Q Exactive HF-X质谱仪在数据依赖采集（data-dependent acquisition, DDA）模式下进行，Proteome Discoverer 2.4软件配合Sequest HT引擎检索；（3）液相色谱-质谱（LC–MS）完整蛋白分析，使用反相高效液相色谱（reversed-phase HPLC）系统结合Q Exactive HF-X质谱仪，Biopharma Finder 5.1软件进行分子量去卷积；（4）N-糖蛋白质组学LC–MS/MS分析，采用zic-HILIC柱富集N-糖肽，GPseeker3软件进行数据检索；（5）MSFragger（FragPipe version 22.0）开放性翻译后修饰分析，采用定位感知开放检索（localization-aware open search, LOS）算法。所有质谱蛋白质组学数据已存入ProteomeXchange联盟iProX数据库（数据集标识符PXD066738）。

**研究结果**

**蛋白含量分析**：研究团队首先通过点免疫印迹验证了仑卡奈单抗与Aβ肽的结合活性，随后利用SDS-PAGE分析其蛋白纯度。非还原条件下，0.25 μg上样量显示主要条带位于170 kDa以上，2 μg上样量则可见约100、70、50及25 kDa等额外条带，推测来源于轻链丢失、重链二聚体、半抗体、Fc-Fab及Fab片段等生产储存过程中常见的抗体亚基组合形式。还原条件下仅有约50 kDa和25 kDa两条条带，证实前述非还原条带均来源于仑卡奈单抗的重链和轻链，表明该药物蛋白纯度极高。蛋白质免疫印迹使用抗人IgG重链抗体检测，确认约50 kDa及以上条带含有重链成分。

LC–MS/MS蛋白质组学分析（三重复）以去离子水为空白对照，结果显示药物样品中主要蛋白为仑卡奈单抗，另有免疫球蛋白、白蛋白、SERPINA1等蛋白；但通过肽段水平比较，仑卡奈单抗为唯一高度富集的蛋白。仑卡奈单抗特有的肽段仅在药物样品中检出，而与免疫球蛋白共有的肽段在药物样品和空白对照中水平相似，证明该药物在蛋白内容上高度纯净。蛋白质组学分析几乎完全测定了仑卡奈单抗的重链和轻链序列，仅155–225位氨基酸区域因胰蛋白酶切肽段过长或过短而未能有效覆盖，验证了仑卡奈单抗氨基酸序列的准确性。

**完整蛋白LC–MS分析**：为深入考察仑卡奈单抗的异质性，研究人员进行了完整蛋白LC–MS分析。色谱图上出现两个分离良好的主要峰，提示药物中存在两种主要蛋白形式；质谱扫描显示两峰的m/z分布非常接近。经去卷积处理，第一峰的分子量分布复杂，范围约140–160 kDa，第二峰则集中于150 kDa；相邻峰间的质量差异达数千道尔顿。凝胶中约100、70、50和25 kDa的条带未在去卷积结果中出现，推测因液相色谱分离效率不足或质谱信号叠加所致。

**N-糖蛋白质组学分析**：糖基化是影响抗体效应功能、Fc结构域与Fc受体及补体C1q结合、抗体稳定性、构象及药代动力学的重要翻译后修饰。研究在重链N304位点（对应人IgG1的N299位点）鉴定到40种N-糖链，其中信号强度最高的为N4H3F0S0（G0），其次为N4H4F0S0（G1）和N2H5F0S0，这三种糖链约占40种总糖链的57%。这一结果与近期报道的209种FDA批准治疗性抗体糖型分析不同——该报道中CHO细胞生产的123种IgG抗体最丰富的糖链包括G0F、G1F、G2F、G0、M5等，而仑卡奈单抗最丰富的糖链为G·，推测与其采用不同的表达系统有关。研究还展示了复杂N-糖链的MS/MS谱图注释，包含肽骨架（b/y离子）和N-糖链部分（A/B/C/X/Y/Z离子）的匹配碎片离子，证明了糖链鉴定的准确性。这些糖链根据质量被归属到完整蛋白LC–MS分析中的不同峰。

**MSFragger修饰分析**：翻译后修饰在单克隆抗体中普遍存在，包括糖基化、C端赖氨酸剪切、N端焦谷氨酸形成、脱酰胺、氧化、糖化、半胱氨酸化、三硫键、羟基化、非酶促片段化、异构化等。研究人员利用MSFragger软件，在全部4567个鉴定的肽段-谱图匹配（peptide-spectrum matches, PSMs）中，有1191个鉴定到修饰。经筛选后，潜在真实修饰包括N端环化（焦谷氨酸形成，pyro-Glu）、色氨酸氧化为犬尿氨酸、羟基化、脱水、醌式结构等。

值得注意的是，除N-糖蛋白质组学分析中重链N304位点的糖链外，MSFragger还在重链恒定域的一个肽段以及轻链的四个肽段上鉴定到己糖修饰，并在其中一个轻链可变域肽段上发现N-乙酰己糖胺修饰。这些修饰可能位于非天冬酰胺残基或代表O-糖基化，因其未在常规N-糖蛋白质组学分析中检出。此外，氧化修饰广泛检出，定位于甲硫氨酸、色氨酸及其他可能未指认的氨基酸，其中重链可变域第20–38位肽段"LSCSASGFTFSSFGMHWVR"中甲硫氨酸的潜在氧化可能影响仑卡奈单抗与Aβ物种的结合。脱酰胺修饰在原始MSFragger结果中广泛存在，但极少通过最终筛选标准进入列表，然而考虑到其通常缓慢产生，可能真实存在。

**讨论与结论**

研究人员指出，SDS-PAGE中显示的部分蛋白条带未在LC–MS完整蛋白分析中检出，除较小蛋白物种分离不佳或超出扫描范围外，更可能是因其m/z与两种主要蛋白物种峰叠加，去卷积算法优先将约150 kDa的完整抗体作为首要目标。多种翻译后修饰可贡献蛋白电荷复杂性：脱酰胺、糖化、唾液酸化和氧化增加负电荷，而C端赖氨酸和谷氨酸/N端谷氨酰胺环化为焦谷氨酸则引入正电荷。MSFragger鉴定的大量翻译后修饰几乎涵盖了上述所有类型，显著增加了仑卡奈单抗的电荷复杂性。SDS-PAGE作为传统方法，简单直观地展示了多种蛋白物种，是研究单克隆抗体纯度的有效补充手段。

这些不同大小的蛋白物种可能是重链和轻链的不同组合，还原后仅显示两条链可证明此点。为进一步解析，可采用¹³C标记的碘乙酰胺（IAA）烷基化游离巯基，随后用DTT还原再用天然IAA烷基化，通过质谱区分¹³C和¹²C IAA加物以定量分析二硫键和游离巯基。

MSFragger翻译后修饰分析是本研究的特色，将成为研究单克隆抗体修饰的有力工具。该分析不仅可鉴定常见修饰，还能发现其他修饰，提供仑卡奈单抗翻译后修饰的全面视图。在全部4567个PSMs中，1191个显示肽段带有修饰，表明相当比例的蛋白拷贝携带某些类型的修饰，这可能超出常规预期，显著增加蛋白多样性，给单克隆抗体质量保障和分子属性表征带来巨大挑战。此外，MSFragger分析揭示重链和轻链上均存在可能影响抗原结合亲和力、IgG效应功能及仑卡奈单抗稳定性的额外糖链，但MSFragger尚需更多验证以确保结果可靠性。

**研究结论**：研究人员以质谱为主要手段对仑卡奈单抗进行了表征。该药物显示多种蛋白物种，SDS-PAGE证实均来源于重链和轻链，可能由轻链丢失或其他亚基组合产生；UV检测液相色谱呈现两个主要峰，为质量差异数千道尔顿的两簇蛋白物种，与糖链分子量相近。N-糖蛋白质组学鉴定了40种复合型N-糖链，主要为N4H3F0S0、N4H4F0S0和N2H5F0S0。MSFragger发现了仑卡奈单抗重链和轻链的修饰全面图谱，包括额外糖基化。仑卡奈单抗中不同大小和修饰的蛋白物种高度多样且复杂，这些数据可为该抗阿尔茨海默病药物的进一步研究提供基础。