用于HER2阳性乳腺癌成像的64Cu卟啉-曲妥珠单抗偶联物的设计

《Chemical & Biomedical Imaging》：Designer 64Cu Porphyrin–Trastuzumab Conjugates for Imaging of HER2-Positive Breast Cancer

　　

人表皮生长因子受体2（HER2）在15–30%的乳腺癌病例中过表达，在发病机制中发挥重要作用，并已被用作诊断指标和治疗靶点。本文描述了一种可生物偶联的卟啉螯合剂，其带有水溶性燕尾基序，该基团投射于大环平面的上方和下方。该卟啉以不同数量与抗HER2抗体曲妥珠单抗的赖氨酸侧链以随机方式反应，获得了一系列偶联比分别为2.3、3.5、4.1和5.2的卟啉-曲妥珠单抗（PorTraz）产物。在HEPES缓冲液（pH 7.2）中于37 °C条件下用⁶⁴Cu对偶联物进行放射性标记，摩尔活度最高达20 μCi/μg（110 MBq/nmol）。结合具有HER2受体特异性，且各偶联物均观察到摄取。在携带HER2⁺ BT-474异种移植瘤的小鼠中，PET成像研究显示显著的肿瘤摄取，注射后24 h肿瘤标准化摄取值（SUV）为0.95 ± 0.08，而HER2^? MDA-MB-468异种移植瘤对照组为0.38 ± 0.12。PorTraz偶联物的肿瘤SUV结果为：每抗体偶联2.3个卟啉螯合剂时为1.25 ± 0.31，每抗体偶联5.2个卟啉螯合剂时为0.59 ± 0.20。综上所述，研究人员合成了一系列卟啉-曲妥珠单抗偶联物并用⁶⁴Cu标记，显示出对HER2⁺细胞的高结合力，并在小鼠肿瘤异种移植瘤中表现出可通过PET/CT成像观察到的摄取。

乳腺癌仍是重大的医疗保健挑战，据估计仅2025年美国就有超过30万新发病例和4.2万例死亡。雌激素受体、孕激素受体以及人表皮生长因子受体2（HER2）等生物标志物被用于乳腺癌分型，因其对癌症侵袭性和总体预后等关键因素具有影响。HER2在15–30%的乳腺癌病例中过表达，通常与更具侵袭性的疾病和更差的预后相关，然而上一代研究在HER2靶向治疗开发方面取得了巨大成功。

曲妥珠单抗是HER2⁺乳腺癌的一种治疗药物，于1998年以赫赛汀（Herceptin）之名获美国FDA批准，其通过抑制HER3/PI3K/AKT通路发挥作用，该抑制作用与体外对HER2⁺细胞的抗增殖效应直接相关。曲妥珠单抗与HER2表面蛋白的FcγIII亚基结合，从而破坏控制肿瘤生长的细胞信号通路的激活与抑制。曲妥珠单抗联合化疗较单纯化疗改善了中位生存期。2013年，FDA批准了抗体-药物偶联物Ado-曲妥珠单抗恩坦辛（Kadcyla），其每个抗体平均携带3.6个恩坦辛分子。恩坦辛作为美坦辛衍生物，可抑制癌细胞微管组装。该化疗药物的选择性递送提高了无进展生存期和总生存期，且毒性低于拉帕替尼联合卡培他滨的标准HER2⁺化疗方案。此外，Kadcyla保留了曲妥珠单抗单药的临床获益，且修饰后抗体亲和力保持不变。

多个研究团队已利用曲妥珠单抗的特异性靶向特性开发HER2成像剂。特别是，⁸⁹Zr-曲妥珠单抗的临床试验已证明其区分HER2⁺与HER2^?疾病的能力，为HER2异质性提供了更深入的认识，并在部分研究中预测了可能的治疗反应。近期研究表明，螯合剂修饰对抗体或其他蛋白构件在靶组织和非靶组织中的生物分布具有影响，这凸显了进一步开发适用于特定应用的螯合剂的必要性。多个团队探索了⁶⁴Cu放射性标记的曲妥珠单抗版本，显示出同样有希望的结果。然而，绝大多数研究采用的螯合剂对⁶⁴Cu相对非特异性。⁶⁴Cu特异性螯合剂-曲妥珠单抗构建物的开发可能为同位素⁶⁷Cu的治疗研究铺平道路。

卟啉的金属螯合特性使其成为放射治疗领域的 attractive 分子类别，1987–1997年间 indeed 出现了大量关于共价连接抗体的卟啉研究。当时研究的卟啉多为天然来源（如血红素）或合成 meso-四芳基卟啉，常含有多个偶联位点或不期望的 bulky 取代基。卟啉合成方法的后续进展如今使得针对特定应用的定制卟啉（designer porphyrins）的创建成为可能。一种受关注的生物医学应用设计采用稀疏取代卟啉（sparsely substituted porphyrins），其中仅使用两个取代基：一个用于水溶性化，一个用于生物偶联。以此方式，卟啉期望的金属螯合特性得以在极简设计中被利用。一种强效的（potent）水溶性化基序为衍生化燕尾单元（swallowtail moiety），其为对称取代的烷基单元，每个末端带有极性基团。当燕尾单元连接于卟啉的 meso-位时，立体因素使两个烷基基团大体垂直于大环平面投射。极性基团在疏水圆盘状大环上下方的投射通过抑制自聚集赋予水溶性。研究人员近期研究了卟啉的放射铜化（radiocupration），包括带有燕尾取代基的卟啉，发现卟啉选择性地与铜发生便捷螯合，且在生理条件下不发生去金属化。此外，卟啉优先与铜发生金属化，即使在含有Fe(II)、Fe(III)、Co(II)、Ni(II)、Cu(II)和Zn(II)的金属化混合物中也是如此。这种对Cu(II)的优先金属化具有吸引力，鉴于放射性金属来源通常含有多种外来金属。

本研究旨在描述一种稀疏取代、水溶性、可生物偶联卟啉的合成，及其与曲妥珠单抗抗体制备偶联物的过程。由于生物偶联反应的随机性，每个PorTraz偶联物均为富含不同数量卟啉螯合剂的混合物，此外还因抗体N-连接糖基化而存在潜在多样性。每个混合物经紫外-可见（UV-vis）吸收光谱、基质辅助激光解吸电离质谱（MALDI-MS）和毛细管电泳质谱（CE-MS）表征。偶联物在温和条件下与铜-64进行金属化，用于HER2⁺乳腺癌细胞系和动物模型的体外及体内研究。

卟啉-抗体偶联物的合成始于水溶性生物偶联卟啉（Por-NHS）的合成。该合成以三组分统计缩合开始：二吡咯甲烷（1）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）酯苯甲醛（2）和燕尾二甲基缩醛（3）。一般而言，二吡咯甲烷与醛A和B的统计反应生成由trans-A₂-卟啉、trans-AB-卟啉和trans-B₂-卟啉按1:2:1比例组成的混合物。使用缩醛代替醛进行卟啉形成已有多年报道。因此，二吡咯甲烷（1）、苯甲醛（2）和燕尾二甲基缩醛（3）在二氯甲烷中于三氟乙酸（TFA）存在下室温缩合，随后以DDQ氧化，经色谱纯化后以16%总产率获得目标trans-AB-卟啉（4）。作为对比，使用4-羧基苯甲醛（而非NHS酯类似物2）和3的醛类似物的类似合成仅以5%产率获得相应的trans-AB-卟啉。随后以TFA处理去除4的2-(三甲基硅基)乙基，获得期望的Por-NHS，量为10 mg。该卟啉含有单个燕尾基团，每个烷基单元末端为羧酸。新型卟啉4和Por-NHS经¹H和¹³C{¹H}核磁共振波谱、UV-vis吸收光谱、MALDI-MS和电喷雾电离质谱（ESI-MS）表征。

多种卟啉-曲妥珠单抗偶联物通过Por-NHS与曲妥珠单抗赖氨酸侧链或N-末端的反应制备。反应在水性NaHCO₃/Na₂CO₃缓冲液（pH 9，后称"aq carbonate"）含5%二甲基亚砜（DMSO）中进行，37 °C反应2 h，这些条件为近期开发的高产偶联条件。Por-NHS与曲妥珠单抗（130 μM）在反应混合物中的比例从3.5:1至14:1不等，以获得具有不同卟啉-曲妥珠单抗偶联比的卟啉-曲妥珠单抗样品（PorTraz-I、II、III、IV和V）。纯化采用离心作用下的尺寸排阻色谱柱。未反应的Por-NHS和卟啉副产物（包括主要水解产物卟啉-三酸Por-CO₂H）被去除。纯化过程还实现了缓冲液的期望更换，从含5 Air 5% DMSO的aq carbonate换至pH 7.2的1 M 2-(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基)乙磺酸（HEPES）缓冲液（后称"aq HEPES"）。

UV-vis吸收光谱用于卟啉-曲妥珠单抗偶联物的表征。曲妥珠单抗和卟啉Por-CO₂H在aq HEPES中的吸收光谱显示：曲妥珠单抗在280 nm处强吸收（ε = 225,000 M^?1cm^?1），但波长大于300 nm时基本无吸收；卟啉在Soret带（401–408 nm；ε = 250,000 M^?1cm^?1）强吸收，但在280 nm处吸收较弱（ε = 6,000–8,000 M^?1cm^?1）。Por-CO₂H的吸收光谱在不同溶剂体系中基本不变，包括aq HEPES、不同比例乙腈/水（25:75、50:50和75:25）以及DMSO。两组分独特的吸收光谱和已知（或测定的）摩尔吸收系数使得偶联比（即连接至抗体的平均卟啉螯合剂数量）的定量评估成为可能。

三种卟啉-曲妥珠单抗偶联物（PorTraz-I、PorTraz-II和PorTraz-III）使用三种不同仪器在不同样品浓度下进行UV-vis吸收光谱分析：Nanodrop One Spectrophotometer（7–12 mg/mL）、Agilent 8453 Spectrophotometer（250 μg/mL，1 cm石英比色皿）和高效液相色谱-二极管阵列检测器（HPLC-DAD）仪器（进样5 μL 2 mg/mL样品）。HPLC色谱条件采用80 °C。三种仪器上三种偶联物的光谱显示：最稀溶液（HPLC-DAD分析）无聚集或光散射迹象，用于偶联比的测定。PorTraz-I、PorTraz-II和PorTraz-III的平均偶联比分别为每抗体2.3、3.5和5.2个卟啉螯合剂。

卟啉-曲妥珠单抗偶联物通过MALDI-MS（一种低分辨率但易获取的方法）进行分析。虽然无法检测到因每个抗体增量卟啉数量导致的峰（游离碱卟啉净增570 Da；曲妥珠单抗约148,500 Da），但观察到由更高卟啉-曲妥珠单抗比例合成的偶联物的质荷比（m/z）明显偏移，与吸收光谱观察到的偶联比一致。

卟啉-曲妥珠单抗偶联物PorTraz-IV（偶联比为每抗体3.5个卟啉螯合剂）与10当量氯化铜(II)（按卟啉计）于37 °C过夜处理。通过游离碱卟啉在600–750 nm处无荧光，确认 exhaustive 铜化形成Cu-PorTraz-IV。尽管曲妥珠单抗为单克隆抗体，Fc区域上多样的N-连接糖基化产生了非相同质量的分布。一种提高光谱清晰度的方法是通过酶处理去除糖基。Zhu等报道的PNGase F酶处理去糖基化方法在此重复，经CE-MS分析显示曲妥珠单抗抗体（M）的主要峰和代表未被去除的带有己糖的曲妥珠单抗的次要峰（M + 162）。同样，Cu-PorTraz-IV的去糖基化获得Cu-PorTraz-IV（D）。CE-MS分析显示质谱中六个主要峰，间隔约630 Da，对应铜卟啉的质量。去糖基化曲妥珠单抗和Cu-PorTraz-IV（D）样品中观察到的次要峰（M + 162）对应于去糖基化过程中保持完整的己糖部分。六个主要峰代表混合物中带0、1、2、3、4和5个卟啉的抗体，鉴于抗体的88个赖氨酸胺和偶联的泊松性质，这是预期的。

各PorTraz偶联物在标准条件下于阿拉巴马大学伯明翰分校与铜-64（t_1/2 = 12.7 h）进行放射性标记，放射化学产率大于90%，用于后续研究。放射化学纯度随比活度增加而降低。在100 μCi/μg比活度时，放射化学纯度按PorTraz-III > PorTraz-II > PorTraz-I的顺序降低。该结果符合预期，因为较多数量的卟啉分子使得更多铜能够被加载到卟啉-抗体偶联物上。

三种放射性标记的[⁶⁴Cu]Cu-PorTraz偶联物在体外进行HER2结合考察。将HER2⁺癌细胞（BT-474细胞系）与多种[⁶⁴Cu]Cu-PorTraz浓度孵育。结果显示，每毫克蛋白结合百分比随[⁶⁴Cu]Cu-PorTraz浓度降低而增加。加入850 nM未修饰曲妥珠单抗的阻断剂量后，几乎所有结合均消失。每毫克蛋白结合百分比的增加表明[⁶⁴Cu]Cu-PorTraz偶联物对HER2⁺细胞的期望结合，而阻断剂量存在下结合的丧失表明对HER2受体的特异性。此外，三种[⁶⁴Cu]Cu-PorTraz构建物在探索范围内（2.3–5.2）对HER2⁺细胞的结合在95%置信区间无显著差异。该细胞结合研究表明：（1）[⁶⁴Cu]Cu-PorTraz在HER2⁺癌细胞中具有高摄取；（2）[⁶⁴Cu]Cu-PorTraz以不同数量偶联卟啉与HER2膜受体结合。

鉴于体外良好结果，卟啉-曲妥珠单抗构建物在两组体内研究中进行了考察。PorTraz-V采用8:1的卟啉-曲妥珠单抗反应物比例制备，纯化后平均为每曲妥珠单抗4.1个卟啉。PorTraz-V以20 μCi/μg比活度进行放射性标记，即时薄层色谱（iTLC）显示98.6%放射化学纯度。携带HER2⁺（BT-474）和HER2^?（MDA-MB-468）肿瘤异种移植瘤的小鼠经尾静脉注射5 μg [⁶⁴Cu]Cu-PorTraz-V。注射后21 h，对小鼠进行PET/CT成像，随后处死进行卟啉-曲妥珠单抗偶联物生物分布分析。结果显示HER2⁺肿瘤的优先摄取，基于SUV表明特异性肿瘤靶向（p < 0.01）。[⁶⁴Cu]Cu-PorTraz-V的生物分布分析显示HER2⁺组肿瘤积累显著增加（p < 0.0001），而其余生物分布与HER2^?组相似，表明[⁶⁴Cu]Cu-PorTraz-V对HER2的特异性靶向。

额外的体内实验考察了带有不同数量卟啉螯合剂的PorTraz偶联物特性。PorTraz-I和PorTraz-III具有不同的平均卟啉-曲妥珠单抗偶联比（分别为2.3和5.2），以10 μCi/μg比活度进行放射性标记。每只小鼠经尾静脉注射5 μg [⁶⁴Cu]Cu-PorTraz-I或[⁶⁴Cu]Cu-PorTraz-III各一。注射后24 h，对小鼠进行PET/CT成像，随后安乐死进行生物分布分析。SUV分析显示，注射后24 h [⁶⁴Cu]Cu-PorTraz-I（1.2 ± 0.3）的肿瘤积累显著高于[⁶⁴Cu]Cu-PorTraz-III（0.6 ± 0.2）（p < 0.001），而[⁶⁴Cu]Cu-PorTraz-V（0.9 ± 0.1）与两者均无显著差异。与[⁶⁴Cu]Cu-PorTraz-III相比，[⁶⁴Cu]Cu-PorTraz-I在心脏（p < 0.001）和肝脏（p < 0.01）的SUV也较高。生物分布分析显示，与PorTraz-I相比，PorTraz-III在多个器官主要呈非显著性降低，在血液和大肠呈小幅度但有统计学意义的降低。PorTraz-III在肿瘤和非靶积累方面的适度降低可能是由于清除率的改变，但尚需额外研究确认。

由于HER2在肿瘤学中的重要靶点地位，已开发了多种成像该受体的方法，包括本文所述的放射性标记完整抗体、放射性标记肽、抗体片段、纳米抗体和微型抗体。抗体方法倾向于在成像后较晚时间点产生更高的绝对肿瘤摄取，而其他方法通常在较早时间点显示足够的肿瘤-背景比以进行可视化。使用FDA批准的完整抗体的重要优势在于其毒性特征已知，为临床转化提供了清晰路径。此外，使用铜-64进行成像较⁸⁹Zr等更长寿命的放射性核素对患者产生更低的辐射剂量。

如近期报道，卟啉大环对铜-64表现出高特异性，这可能对放射治疗诊断学（radiotheranostics）具有吸引力。本研究的绝对肿瘤摄取略低于若干报道的研究，但这可能是由于使用了HER2表达水平不同的动物模型。Woo等近期报道中，⁶⁴Cu-NOTA-曲妥珠单抗偶联物在BT-474模型中给出与本研究相似的肿瘤-血液和肿瘤-肌肉比值；另一方面，当前研究数据显示大肠信号较高。对不同溶解基团卟啉的进一步研究可能有助于阐明分子设计对生物分布的影响。

稀疏取代的生物偶联卟啉与曲妥珠单抗结合，获得一系列偶联比（2.3–5.2）的卟啉-曲妥珠单抗产物。偶联物经UV-vis光谱、MALDI-MS和CE-MS分析，并以高达111 MBq/nmol的摩尔活度和大于90%的放射化学产率与铜-64进行放射性标记。不同平均数量卟啉螯合剂每抗体的偶联物在体外对BT-474（HER2⁺）细胞显示相似的免疫反应性。一种卟啉-曲妥珠单抗偶联物在BT-474（HER2⁺）细胞体内研究中与MDA-MB-468（HER2^?）细胞相比表现出显著摄取（p < 0.0001）。另两种卟啉-曲妥珠单抗偶联物（偶联比2.3 vs 5.2）显示，每抗体带有更多卟啉螯合剂的偶联物在肿瘤、心脏和肝脏的SUV降低。结果提示定制卟啉在放射治疗诊断学中的应用价值。