《Journal of the American Chemical Society》：Tracking Gene Expression of Single Mitochondria in Live Neurons Using Nanotweezers
神经元是高度极化的细胞，其能量与信号稳态依赖线粒体维持。重要的是，能量与信号需求在不同神经元间乃至同一神经元内均存在显著的空间与时间差异。因此，为全面理解神经元线粒体，亟需能够在活细胞中随时间分析线粒体的方法。纳米镊（nanotweezer）作为一种微创单细胞采样技术，可实现从特定亚细胞位置精确提取单个线粒体。本研究将活体神经元中的单线粒体提取与靶向线粒体基因表达追踪及线粒体DNA（mtDNA）分析相结合，建立了活细胞单线粒体追踪与分析平台。通过在同一神经元中随时间追踪特定线粒体编码基因的表达，研究揭示了初步数据：在暴露于α-突触核蛋白（α-synuclein, α-syn）聚集体后，线粒体基因MT-ND1和MT-ATP6发生下调，且该效应独立于聚集体与采样线粒体的空间距离。该方法为在体外以单细胞器分辨率精确、动态地测量线粒体组成与靶向基因表达提供了概念验证，为神经元线粒体异质性及其在神经退行性疾病模型中扰动的单细胞与单细胞器研究开辟了机遇。
神经元因其 disproportionately 高的三磷酸腺苷（ATP）需求而高度依赖线粒体。线粒体功能障碍是衰老与神经退行性疾病（包括帕金森病（Parkinson's disease, PD）、阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）和肌萎缩侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis, ALS））的核心特征。神经退行性疾病中已发现mtDNA拷贝数降低及mtDNA异质性（heteroplasmy）升高。线粒体基因表达失调与线粒体动力学异常亦被观察到，影响突触传递、膜电位维持、钙缓冲及细胞凋亡。神经元亚区室中存在不同的线粒体亚群，例如突触线粒体在形态、蛋白质组学特征、酶活性、钙缓冲能力及脆弱性方面均与非突触线粒体存在差异。结合特定神经元区室在神经元丢失前即选择性退化的认识，凸显了对单个神经元内区室化线粒体异质性进行研究的需求。
单细胞分析技术已实现对神经元mtDNA异质性的表征，但在单细胞水平理解异质性仍具巨大潜力。已有研究利用FluidFM进行线粒体移植，将多个线粒体及线粒体网络片段从HeLa细胞移植至U2OS细胞及原代人表皮角质形成细胞。然而，基于微吸管或纳米吸管的单细胞采样技术需依赖机械采样或细胞质抽吸来提取细胞内容物。近期，一种自动化纳米活检平台被开发用于线粒体移植与传感。
理解神经元线粒体分布的空间差异以及病理标志物（如蛋白聚集）对神经元线粒体的局部影响，可通过分析活体神经元中单个线粒体的组成来进一步推进。这将有助于在单细胞器分辨率下精确揭示线粒体机制并识别新型治疗靶点。已有高分辨率成像研究观察到线粒体翻译产物在海马神经元轴突、树突及突触区域的分布。此外，利用微吸管和纳米吸管从神经元中采样单个线粒体并结合测序技术以研究线粒体异质性的方法已有报道。但目前尚无方法能够实现单个线粒体的分离与分析以追踪活细胞中的线粒体基因表达。单细胞采样方法与分析方法的进一步进步，有望显著改善对基础线粒体生物学的理解，并促进新型细胞机制的发现及神经退行性疾病治疗干预手段的开发。
为填补这一空白，研究人员进一步发展了纳米镊子技术。该技术通过局部介电电泳（dielectrophoretic, DEP）捕获而非大量细胞质抽吸，实现从活细胞中进行微创生物分子提取。此前已证实可从神经元轴突中提取单个线粒体并进行重复细胞质采样而不影响细胞活力。近期更显示可在同一活体神经元（包括神经突）中进行多次细胞质提取而不影响细胞活力，这对于体外培养的脆弱神经元而言尤为显著。本研究进一步将同一神经元中多次单个线粒体提取与单线粒体mtDNA及mtRNA分析相结合，实现活体神经元中的单细胞器分析。此外，研究人员展示了在α-突触核蛋白（α-syn）寡聚体摄取后，可从同一细胞的特定神经元位置及不同时间点分离单个线粒体，从而在急性毒性模型中实现对活体神经元中选定线粒体编码转录本的追踪。
**从活体神经元中提取单个线粒体**
为从活体神经元中分离单个线粒体，研究人员利用纳米镊子对神经突中的线粒体进行纳米活检提取。通过转染mtDsRed对体外神经元线粒体进行荧光标记，使线粒体基质得以被特异性靶向。利用明场成像将纳米镊子手动插入神经元中邻近标记线粒体的位置。随后通过荧光监测单个线粒体的提取过程：施加交流电压于线粒体附近，使线粒体通过DEP捕获于纳米镊子尖端，表现为线粒体荧光向纳米镊子尖端移动；随后将纳米镊子从细胞中撤出，提取被捕获的线粒体，表现为被分离线粒体荧光的丧失。为进一步确认线粒体从细胞中的成功提取，在细胞外观察到纳米镊子尖端存在荧光，且移动纳米镊子时该荧光持续存在，确认线粒体被捕获于尖端。
为评估纳米镊子捕获的线粒体的线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential, MMP）保存情况并确认从细胞中分离的是完整线粒体，研究人员使用四甲基罗丹明甲酯（tetramethylrhodamine methyl ester, TMRM）进行了单线粒体纳米活检。TMRM是一种易被具有完整且活性MMP的线粒体摄取的荧光探针。观察了线粒体在纳米镊子DEP应用前、应用中以及从细胞提取后的荧光变化。提取成功表现为DEP应用时纳米镊子尖端荧光增强，表明靶向线粒体向尖端移动。分离后线粒体的MMP保存得到验证：捕获过程中未观察到线粒体荧光丢失，且从细胞提取后荧光仍保留于纳米镊子尖端。为探究纳米活检对细胞中剩余线粒体的可能影响，研究人员测量了同一细胞中邻近及非邻近线粒体在纳米活检过程中的荧光，并与未接受纳米活检的邻近细胞中的线粒体荧光进行比较。结果显示线粒体荧光强度保持恒定，表明对同一细胞中线粒体MMP的影响极小。还通过测量纳米镊子尖端外捕获线粒体的荧光强度，研究了提取对线粒体MMP的长期影响，证明以纳米镊子分离的线粒体至少可维持MMP 90分钟。
**单线粒体分析**
在证实可使用纳米镊子从神经元中提取完整线粒体且不影响MMP后，研究人员开发了分析单线粒体内容的方案。首先，通过单线粒体裂解和纯化后的定量聚合酶链式反应（quantitative polymerase chain reaction, qPCR）成功检测到mtDNA。mtDNA仅在纳米活检样本中被检测到，qPCR阴性对照和纯化对照中均无扩增。阴性对照为无模板对照，包含所有qPCR试剂并以无核酸酶水替代DNA。纯化对照则是将裂解和纯化步骤应用于无核酸酶水。为探究线粒体或mtDNA对纳米镊子的非特异性黏附，研究人员将纳米镊子插入细胞培养基及细胞本身而不施加DEP，这些额外对照显示与提取的线粒体相比扩增极少。
在从每个线粒体检测到mtDNA后，研究人员采用绝对定量获得了单个线粒体的mtDNA拷贝数。14个以纳米镊子提取的线粒体中，9个检测到扩增，拷贝数范围为每线粒体0至13个，与此前报道的mtDNA拷贝数估计值相似。需要强调的是，绝对qPCR定量基于标准曲线的构建，尽管本研究构建的标准曲线具有较高的R
2值（0.99）且引物具有良好的PCR效率（96%），但移液误差、各孔扩增效率及样品混合的微小变异仍可能影响定量，尤其在评估所述范围的拷贝数时。因此，以这种方式进行的单线粒体mtDNA定量可能更适合于并行处理样品间的相对比较，而非考察单一类型样品内的绝对数值。例如，此处描述的方法可用于比较同一神经元亚细胞区室内的mtDNA拷贝数，或用于比较健康与PD神经元中的线粒体。
随后，研究人员对纳米镊子提取的线粒体进行了DNA纳米孔测序。未经扩增的单线粒体测序未成功，可能原因是单个线粒体含有极少的mtDNA拷贝，且在样品和文库制备过程中可能丢失材料。为解决此问题，研究人员对MT-RNR2基因的一个558 bp区域进行了PCR扩增后测序。从神经元中分离单个线粒体后，进行裂解和纯化，使用高保真聚合酶扩增MT-RNR2基因内的558 bp区域，随后成功进行纳米孔测序：一致性序列与参考序列100%比对，中位质量分数为15.0，中位准确度分数为98.4%。
研究人员还开发了从单个线粒体分析RNA的方案。由于每个线粒体的mtDNA含量可能不同，需将mtDNA排除在基因表达分析之外。由于线粒体编码的RNA不含内含子，无法使用跨越外显子-外显子连接点的引物进行逆转录 quantitative PCR（reverse transcription quantitative PCR, RT-qPCR）。为此，研究人员修改了线粒体裂解后的纯化步骤，利用表面功能化的磁珠进行靶标特异性结合区域富集。该靶标特异性结合区域包含用于结合多聚腺苷酸化RNA的25个胸腺嘧啶核苷酸重复寡核苷酸，以及序列互补于12S rRNA的寡核苷酸，从而实现mtRNA的选择性富集并避免mtDNA的携带，否则可能导致假阳性的基因表达分析。
mtRNA在无mtDNA的情况下成功被分离和检测，无RT对照中未检测到mtDNA即证实了这一点。纳米活检提取的mtRNA检测得到进一步支持：纳米活检分离的线粒体中mtRNA浓度显著高于纯化、培养基和RT-qPCR对照。纯化对照作为额外的阴性对照，使用水按照所述方法进行分析，以确保检测到的mtRNA并非来自分析过程中的污染。培养基对照代表从细胞外进行纳米活检获得的mtRNA，用于排除任何潜在的游离线粒体或mtRNA。这些结果共同表明，可从纳米镊子提取的单个线粒体中分析mtRNA，且检测到的mtRNA来源于被提取的线粒体。然而，低模板PCR衍生的绝对拷贝数在此概念验证之外应谨慎解读。
**空间分辨率单线粒体提取显示α-突触核蛋白寡聚体的邻近性不决定特定转录本的线粒体基因表达**
为展示在单个神经元内探究线粒体编码基因表达谱的能力，研究人员在急性毒性模型中研究了N-末端乙酰化α-syn（以下称α-syn）聚集与选定线粒体转录本之间的相互作用。此前工作提示α-syn聚集体与神经元线粒体之间存在直接相互作用，α-syn（包括寡聚体）可穿过细胞膜并定位于线粒体膜附近，靠近ATP合酶（复合物V）和线粒体复合物I等线粒体蛋白。
由于小的可溶性寡聚体被认为是α-syn毒性最大的形式，研究人员制备了包含寡聚体的聚集混合物。通过原子力显微镜（atomic force microscopy, AFM）确认了聚集和寡聚体形成，表现为培养过程中等效圆盘半径增加和尺寸分布变宽。为仅研究α-syn寡聚体的效应，使用α-syn聚集体特异性荧光标记适配体对蛋白质混合物进行标记。荧光标记的α-syn寡聚体与mtDsRed标记的神经元孵育24小时以允许细胞摄取，随后洗去多余部分，使神经元中的α-syn寡聚体和线粒体均可被成像。
α-syn通道与线粒体通道的重叠显示，部分α-syn寡聚体靠近单个线粒体，部分则不靠近。空间邻近性定义为α-syn与线粒体通道的重叠。为探究这种邻近性是否影响单线粒体特定转录本的基因表达，研究人员使用纳米镊子提取了与α-syn寡聚体重叠和不重叠的单个线粒体。纳米镊子的高空间精度实现了线粒体的特异性选择。使用图3a scheduled方法分析每个线粒体的特定转录本基因表达，并利用标准曲线进行每个线粒体的绝对拷贝数定量。为最小化单细胞器绝对定量中的技术误差，线粒体转录本与同一qPCR板内的阴性对照并行分析，以实现相对比较并控制技术变异性。
令人惊讶的是，与α-syn寡聚体重叠和不重叠的线粒体之间，MT-ND1、MT-ATP6、MT-CO1和MT-RNR1的表达均无显著差异。因此，这些发现不支持α-syn寡聚体对这些线粒体编码基因的直接影响的观点。
**单细胞靶向线粒体基因表达追踪显示α-突触核蛋白寡聚体暴露导致MT-ND1和MT-ATP6的抑制**
为在单细胞水平研究α-syn寡聚体对特定线粒体基因表达谱的影响，研究人员在急性α-syn毒性模型中，利用纳米镊子在24小时内从同一活体神经元中提取多个单个线粒体。单细胞基因表达追踪使同一活细胞能够被探测，揭示基因表达的变化并揭示群体研究中被掩盖的细胞异质性。
研究人员首先在正常培养条件下从同一细胞中提取多个单线粒体，随后将聚集的α-syn混合物与细胞孵育24小时，洗去后再次定位同一细胞并提取多个单个线粒体，从而在两个时间点提供来自单细胞的单个线粒体群体。使用标准曲线对每个线粒体的特定线粒体编码基因表达进行绝对拷贝数定量分析。评估同一细胞中MT-ND1、MT-ATP6、MT-CO1和MT-RNR1的总体变化，以提供对细胞间变异性不太敏感的相对纵向同细胞分析，并与使用不含蛋白质的缓冲液替代α-syn混合物的相应对照细胞的线粒体进行比较。
值得注意的是，MT-ND1和MT-ATP6基因（分别编码线粒体复合物I和V的亚基）的表达在α-syn处理后显著低于对照条件，而MT-CO1或MT-RNR1则无显著变化。这一活细胞追踪结果与此前显示聚集α-syn或PD组织中影响线粒体复合物I和V的工作一致。为理解特定线粒体编码表达变化是否导致线粒体功能影响，研究人员对α-syn处理和对照细胞进行了TMRM检测，显示α-syn处理细胞相比对照细胞MMP显著降低。
这些结果表明，聚集α-syn的存在降低了神经元中MT-ND1和MT-ATP6的表达，且这与MMP降低同时发生。然而，研究人员未发现单个细胞水平MT-ND1和MT-ATP6的下调与α-syn寡聚体到单个线粒体的邻近性之间的关系。线粒体运动性可能导致这种影响随时间变得更加弥散；或者，α-syn聚集体对线粒体基因表达的影响可能并非由于寡聚体与线粒体的直接相互作用，而可能是间接效应，例如α-syn毒性在细胞其他区域产生的下游效应——聚集体可能破坏线粒体与内质网（endoplasmic reticulum, ER）之间的通讯，从而影响脂质交换和钙信号；也可能触发ER未折叠蛋白反应，进而向线粒体传递凋亡信号并改变线粒体基因表达。此外，聚集体可能通过破坏微管稳定性和/或干扰马达/衔接蛋白（如Miro）改变神经元内的细胞内运输，从而影响线粒体自噬（mitophagy），进而改变线粒体基因表达。
**讨论**
在本研究中，研究人员利用精确的微创单细胞纳米活检技术，以高空间和时间分辨率从活体神经元中提取单个线粒体。该方法维持细胞于其天然微环境中，不依赖细胞质抽吸或细胞内容的机械采样。研究人员证实可使用纳米镊子从神经元中提取单个线粒体而不影响神经元活力。提取后MMP的维持突显了该技术用于线粒体移植的潜力，正如其他单细胞采样方法已实现的那样。实验中，特异性通过荧光引导靶向、空间限制采样和下游分子验证的结合来实现：采样阶段，活神经元中的线粒体经荧光标记，使纳米镊子尖端可在DEP施加前直接定位于视觉识别的单个线粒体旁，显著降低捕获非相关物质的概率；采样从形态上分离的神经突线粒体而非拥挤的核周区域进行，进一步减少目标选择的不确定性。提取过程中，成功捕获通过选定的荧光线粒体向纳米镊子尖端移动及原始位置信号丧失来视觉确认。分析阶段，特异性进一步得到分子工作流的验证：mtDNA分析中，线粒体靶标被扩增并包含适当对照以排除污染或非特异性携带；mtRNA分析中，使用表面功能化磁珠进行靶标富集纯化步骤以分离线粒体转录本同时最小化mtDNA携带。因此，尽管DEP捕获机制本身并非化学选择性的，但整体工作流确保了报告信号来源于靶向线粒体。未来可通过亲和辅助或表面功能化捕获策略进一步增强工作流的特异性。
单线粒体分析方法的发展证明，可从单个线粒体获得关于mtDNA拷贝数、可识别mtDNA突变的mtDNA序列以及选定线粒体编码基因表达的信息。直接无扩增纳米孔测序的尝试未成功，最可能的原因是单个线粒体含有极少的mtDNA拷贝，在样品和文库制备过程中不可避免会丢失材料。研究人员展示了从单个线粒体分析选定线粒体编码转录本的可行性。虽然本工作的主要进展是建立并展示了活细胞单线粒体追踪与分析平台，但其未来可能为高度定位化的线粒体基因表达追踪以及单细胞器分子变化与细胞功能的关联开辟机遇。研究人员进一步证明了从同一活体神经元进行重复采样的可行性，并检测到与处理相关的特定线粒体转录本的方向性变化。
通过在相同细胞中随时间测量特定线粒体转录本，研究人员追踪了选定转录本对单个神经元中α-syn聚集体存在的响应。尽管仅为初步结果，且不反映神经退行性疾病（如PD）中内源性α-syn积累的完整慢性生物学过程，但研究揭示了这些聚集体可在急性毒性模型中导致编码线粒体复合物I和V亚基的基因下调。鉴于细胞内基因表达的动态特性，该方法展示了从细胞基态到处理状态追踪靶向线粒体转录本的概念验证，有望揭示细胞的内在异质性和变异性并提供更准确的单细胞响应描述。有趣的是，研究人员在单细胞水平未发现MT-ND1和MT-ATP6的下调与α-syn寡聚体到单个线粒体的邻近性之间的相关性。随着进一步采样和分析，这可能提示线粒体功能障碍可能源于与聚集前α-syn物种的相互作用。
总体而言，研究人员展示了一种用于提取和分析活体神经元中单个线粒体的强大工具。该方法的一个重要显著优势在于纳米镊子的 exceptional 精度，可选择细胞内特定区域的感兴趣线粒体，且对细胞影响极小，从而实现活细胞单细胞器测量。当前技术的局限性包括可从单个线粒体分析的线粒体编码基因数量有限，限制了单个细胞器的全面基因表达分析，以及低丰度转录本的分析能力。每个线粒体内核酸含量的更好保存，结合高灵敏度测序方法的持续发展，将进一步增强该技术的威力。尽管分析中未找到稳定的线粒体编码持家基因，但未来可能纳入其他标准化指标，如线粒体体积。还需要更大规模的研究来充分确立单细胞内线粒体异质性和线粒体基因表达响应的程度。研究人员预期纳米镊子将成为研究活细胞线粒体景观的有价值技术。
