食品与健康应用潜力相关的Aspergillus cristatus CCNH008安全性评估

《Foods》：Safety Assessment of Aspergillus cristatus CCNH008 for Potential Use in Food and Health Applications

　　

Aspergillus cristatus是参与伏砖茶发酵的关键微生物，但尽管其在黑茶生产中具有悠久的使用历史，系统性的菌株水平安全性数据仍然有限。本研究通过急性经口毒性试验、包含恢复期的90天重复经口毒性研究以及遗传毒性试验，对A. cristatus CCNH008的毒理学安全性进行了评估。在急性经口毒性试验中，CCNH008在小鼠和大鼠中均未导致死亡，未见不良临床体征，且对体重或病理学未产生与处理相关的影响，其半数致死量（LD₅₀）大于10 g/kg体重。在大鼠90天重复经口毒性研究中，以最高达1.67 g/kg体重/天的剂量口服给予CCNH008，未引起与处理相关的临床体征、体重、摄食量、血液学或生物化学参数、尿液分析、器官重量或组织病理学变化，在28天恢复期内亦然。遗传毒性采用细菌回复突变试验、体外哺乳动物染色体畸变试验和体内哺乳动物红细胞微核试验进行评价；均未观察到致突变或致染色体断裂效应。综上，这些发现表明CCNH008未显示急性毒性、亚慢性经口毒性或遗传毒性的证据，为支持其在食品相关产品中的潜在应用提供了重要的菌株水平安全性证据。

《Foods》发表的这项研究围绕冠突曲霉（Aspergillus cristatus）CCNH008的菌株水平安全性展开，研究背景源于伏砖茶作为中国传统后发酵黑茶，其“金花”形成被视为品质标志，而A. cristatus正是这一发酵过程中的关键功能微生物。既往研究已表明该菌可参与茶叶香气与滋味形成，并可能产生蒽醌、多糖和挥发性成分等生物活性代谢物，因此具有向功能食品及健康相关产品拓展应用的潜力。然而，曲霉属（Aspergillus）同时包含多种可产生黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A和柄曲霉素等毒性代谢物的成员，食品基质中检测到曲霉并不天然意味着安全。尤其是在拟将某一特定菌株用于更广泛食品开发时，仅凭传统食用历史并不足以替代系统性的毒理学证据，因此开展菌株水平的安全性评价具有明显必要性。

在此背景下，研究人员选取分离自湖南黑茶“金花”发酵过程的A. cristatus CCNH008作为研究对象，并基于ITS（internal transcribed spacer，内转录间隔区）测序确认其分类地位，菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC）。研究的核心问题是：该菌株在急性经口暴露、亚慢性重复经口暴露以及遗传毒性层面是否存在安全风险；如果不存在，则可为其在食品相关产品中的应用提供直接毒理学依据。研究的总体结论是，CCNH008在所测试条件下未显示急性经口毒性、90天亚慢性经口毒性以及遗传毒性信号，提示该菌株具有较好的安全性特征。其重要意义在于，这项工作并非停留在物种层面的“通常认为安全”，而是进一步提供了具体菌株的实验毒理学证据，为传统发酵来源微生物向现代食品产业转化提供了更坚实的安全基础。

研究人员主要采用了几类关键技术方法。首先，建立A. cristatus CCNH008孢子粉制备体系，以小鼠和Sprague Dawley（SD）大鼠开展急性经口毒性试验及90天重复经口毒性试验，并设置28天恢复观察期以判断效应是否可逆或持续。其次，围绕遗传毒性，采用Salmonella typhimurium回复突变试验（Ames试验）、小鼠骨髓哺乳动物红细胞微核试验以及中国仓鼠肺（CHL）细胞体外染色体畸变试验进行综合评价。动物来源包括SPF级昆明小鼠和SPF级SD大鼠，相关实验均依据中国国家食品安全标准实施，并结合血液学、血清生化、尿液分析、器官重量与组织病理学进行系统判定。

在“Acute oral toxicity of strain CCNH008”部分，研究人员通过小鼠和大鼠急性经口毒性试验评估单次高剂量暴露后的即时毒性反应。结果显示，小鼠在给药后整个14天观察期内活动、姿势和被毛状态均正常，无毒性临床表现，也未出现死亡；体重持续增长，增幅处于该品系正常生理范围内，尸检未见主要脏器肉眼异常。大鼠试验中，给药后0.5–4 h内可见一过性活动减少、轻度上睑下垂和流涎，但均在24 h内恢复正常；其后14天内未见进一步处理相关临床症状或死亡，体重同样正常增长，肉眼病理检查未发现器官异常。基于鼠和大鼠结果，研究人员认定CCNH008经急性经口暴露后属于实际无毒水平，LD₅₀大于10 g/kg体重。

在“Ninety-Day Oral Toxicity study of strain CCNH008”部分，研究人员通过90天重复灌胃并设置恢复期，评价CCNH008的亚慢性全身毒性。结果表明，各剂量组大鼠在给药期间均未出现与处理相关的临床症状或明显中毒表现。虽然个别时间点在摄食量、体重或体重增长方面出现统计学差异，但这些变化不具备明确剂量-反应关系，也不持续，且落在历史对照波动范围内，因此被视为偶发变化。血清生化和血液学检测中，白蛋白（Alb）、甘油三酯（TG）、钠离子（Na⁺）、中性粒细胞百分比（NEUT%）、单核细胞百分比（MONO%）、凝血酶原时间（PT）和淋巴细胞百分比（LYMPH%）等少数指标在个别组别和个别时点出现统计学差异，但变化幅度小、分散且不持续，也未与器官重量改变或组织学损伤相伴随，因此不支持处理相关毒性。尿液分析方面，各组在外观、pH、比重、蛋白、隐血和葡萄糖等指标上与对照组均无显著差异，提示未观察到肾功能或泌尿系统不良影响。剖检、器官重量及组织病理学检查进一步显示，90天暴露期末及28天恢复期后均未见与CCNH008相关的肉眼病变、器官重量异常或剂量依赖性病理改变，少量轻微病变被判定为背景性偶发损伤。整体而言，该部分研究支持CCNH008在最高1.67 g/kg体重/天条件下不引起明确亚慢性经口系统毒性。

在“Genotoxicity Study of strain CCNH008”部分，研究人员从基因突变、染色体损伤和体内微核形成三个层面评价遗传毒性风险。

在“3.1. Ames Test”部分，研究人员首先通过预试验确定CCNH008孢子粉在水、二甲基亚砜（DMSO）和丙酮中均表现为悬浮状态，并因2500 μg/plate以上析出影响计数而将2500 μg/plate设为主试验最高剂量。采用TA97a、TA98、TA100、TA102和TA1535五种标准回复突变菌株，在有无S9代谢活化系统条件下进行两次独立主试验。结果显示，所有测试菌株在各剂量下的回复突变菌落数均未超过相应溶剂对照的2倍，也未见剂量-反应关系，说明在最高2500 μg/plate条件下，CCNH008未诱导受试细菌发生基因突变。

在“3.2. Mammalian Erythrocyte Micronucleus Assay”部分，研究人员采用小鼠骨髓红细胞微核试验评价体内遗传毒性。结果表明，1.67、0.84和0.42 g/kg体重剂量组雌雄小鼠的微核多染红细胞频率与溶剂对照组比较均无显著差异，同时各处理组多染红细胞（PCEs）占总红细胞比例均不低于对照组的20%，提示未对骨髓造血产生细胞毒作用。由此可见，CCNH008在体内条件下未诱导小鼠骨髓红细胞微核形成增加，微核试验结果为阴性。

在“In Vitro Mammalian Cell Chromosomal Aberration Assay”部分，研究人员利用CHL细胞评估CCNH008是否会导致染色体水平损伤。细胞毒性预试验显示，在有或无S9活化条件下，4 h处理时1250 μg/mL可使有丝分裂指数降至约50%，因此被确定为主试验最高浓度。主试验结果显示，在1250、625和312.5 μg/mL浓度下，无论是否加入S9，染色体畸变频率均未较阴性对照显著升高。由于短时暴露试验结果为阴性，研究人员进一步进行了无代谢活化的24 h延长处理试验，并根据预试验将625 μg/mL定为最高浓度；结果仍未见任何剂量组染色体畸变率显著增加。综合说明，在所测试的浓度范围、暴露时间及代谢活化条件下，CCNH008不诱导CHL细胞染色体畸变。

讨论部分主要围绕统计学差异与生物学相关性的区分、结果与既往曲霉安全性资料的一致性，以及菌株水平评价的必要性展开。研究人员指出，急性经口毒性与90天重复经口毒性研究共同表明，CCNH008具有较低的急性毒性特征，在测试条件下不产生明确的亚慢性系统毒性。对血清生化和血液学中少量统计学显著变化的解释强调，单纯统计学显著并不等同于毒理学相关性，还需结合变化幅度、模式、持续性以及是否伴随器官重量和组织病理损伤综合判断。由于本研究中的变化呈零散、轻微、缺乏剂量依赖性且无相关组织损伤，因此更符合正常生物学波动，而非处理相关毒性。研究人员还指出，轻度Alb和TG下降并不足以支持肝损伤判断，因为未见肝酶持续升高或组织学病变；中性粒细胞和淋巴细胞比例的短暂波动也未伴随炎症性病变，因此不支持免疫毒性。遗传毒性三项试验均为阴性，则进一步强化了其整体安全性证据。结合既往关于食品相关曲霉菌株、尤其是A. niger和A. oryzae来源食品酶制剂的安全评价，以及A. cristatus缺乏已知致癌物生成基因簇的基因组学证据，研究人员认为CCNH008处于食品相关曲霉工业应用的一般安全范围之内。同时，论文也强调，尽管A. cristatus通常被视为与传统黑茶发酵相关的有益真菌，但由于同一物种内不同菌株安全性可能存在差异，因此在拓展食品用途前进行菌株水平毒理学评价仍然必要。本研究由此为CCNH008在食品相关产品中的潜在安全应用提供了直接支持。

研究结论部分可译为：总体而言，本研究结果表明，在本研究设定的测试条件下，Aspergillus cristatus CCNH008不存在急性经口毒性、亚慢性经口毒性或遗传毒性风险。随着功能性发酵食品受到越来越多关注，在菌株水平开展系统性安全评价至关重要。因此，本研究结果为CCNH008在人类食用食品中的潜在安全应用提供了支持性证据。尽管当前结果证实该菌株具有良好的安全性特征，但要完成全面安全评估，仍需进一步开展生殖与发育毒性研究，以及采用非啮齿类动物的研究。这些后续工作将为CCNH008更广泛应用的安全性提供进一步证据。