基于离体叶片急性低温胁迫生理响应的七种冬青属(Ilex)植物抗寒性初步评价

《Plants》：Preliminary Cold Tolerance Evaluation of Seven Ilex Species Based on Physiological Responses of Detached Leaves to Acute Low-Temperature Stress

　　

摘要：冬青属(Ilex L.)是冬青科(Aquifoliaceae)唯一属，具有较高的观赏价值。然而冬季低温限制了其常绿种类在寒冷地区的分布。本研究以七种常绿冬青栽培品种的离体叶片为材料进行急性低温胁迫处理，测定关键生理参数[细胞膜透性、渗透调节物质及叶绿体色素(chloroplast pigments)]。结果表明：低温胁迫下，相对电导率(relative electrical conductivity, REC)和丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量随温度降低而升高，可溶性蛋白(soluble protein, SP)、可溶性糖(soluble sugar, SS)及游离脯氨酸(free proline, Pro)含量则呈先升后降趋势。REC与MDA及SP呈正相关，与Pro呈负相关。随机森林(random forest, RF)分析显示MDA、Pro和叶绿素a(chlorophyll a, Chl a)共同解释了REC变异的72.6%。上述发现揭示了常绿冬青离体叶片对急性低温胁迫的生理响应，并为初步评估其抗寒性(cold tolerance)提供了依据。

基于离体叶片急性低温胁迫生理响应的七种冬青属(Ilex)植物抗寒性初步评价——论文解读

该研究发表于《Plants》期刊。冬青属(Ilex L.)为冬青科(Aquifoliaceae)唯一属，约600种，广泛分布于热带、亚热带及温带地区，其中常绿种因四季常青及冬季宿存核果具高观赏价值，在园林中应用广泛。但冬季低温限制了常绿冬青在高纬度寒冷区的引种与分布，而目前对常绿冬青低温生理响应机制及抗寒品种筛选的研究仍较匮乏，因此有必要在可控条件下对其抗寒性进行初步评价，为寒冷地区园林绿化提供理论参考。研究人员以七种三年生扦插苗的成熟离体叶片为材料，设置5 ℃、0 ℃、-5 ℃、-10 ℃、-15 ℃、-20 ℃梯度降温（降温速率0.8 ℃·min^?1，各温阶维持2 h），测定REC、LT₅₀（Logistic方程拟合）、MDA（硫代巴比妥酸法）、SS（蒽酮比色法）、SP（考马斯亮蓝G-250法）、Pro（茚三酮比色法）及叶绿素a(Chl a)、叶绿素b(Chl b)、类胡萝卜素(carotenoids, Car)（乙醇提取法），并进行相关性分析与随机森林(RF)模型分析，初步明确不同冬青种的抗寒生理差异及关键评价指标。

主要关键技术方法：

研究人员选取南京江苏省中国科学院植物研究所冬青园三年生露地栽培、无病虫害且生长一致的七种常绿冬青(Ilex opaca、Ilex × cassine、Ilex cornuta 'Lutea-carpus'、Ilex cornuta 'Dwarf Burfordii'、Ilex 'Nellie R.Stevens'、Ilex × 'China Girl'、Ilex dabieshanensis)当年生枝条第2～5位成熟叶为样本，离体洗净预冷(5 ℃过夜)后于程序降温仪中以0.8 ℃·min^?1从5 ℃降至-20 ℃（-20 ℃、-15 ℃、-10 ℃、-5 ℃、0 ℃、5 ℃各温阶保温2 h黑暗处理）。解冻后打取6 mm叶圆片，测定相对电导率(REC，电导仪法，计算LT₅₀拟合Logistic方程y=k/(1+ae^?bx)，k=100，LT₅₀=lna/b)、丙二醛(MDA，硫代巴比妥酸法)、可溶性糖(SS，蒽酮比色法)、可溶性蛋白(SP，考马斯亮蓝G-250法)、游离脯氨酸(Pro，茚三酮比色法)及叶绿体色素[叶绿素a(Chl a)、叶绿素b(Chl b)、类胡萝卜素(Car)，乙醇提取法]。数据经Shapiro–Wilk正态性与Levene方差齐性检验后行单因素方差分析与Duncan多重比较(p<0.05)，Pearson相关性分析探讨指标关联，Python构建随机森林(RF)模型(n_estimators=100，10折交叉验证，Min-Max归一化)量化各生理因子对REC变异的重要度。

3. Result（结果）

3.1. Response of Membrane Stability to Low Temperature（膜稳定性对低温的响应）：

所有品种REC随降温总体上升，5 ℃至-10 ℃变化较缓，-10 ℃以下除Ilex opaca外急剧上升；-20 ℃时Ilex opaca REC最低(27.61%)。MDA含量随降温持续升高，Ilex dabieshanensis于-20 ℃达最高(17.37 μmol·g^?1)，Ilex cornuta 'Dwarf Burfordii'与Ilex 'Nellie R.Stevens'自-15 ℃至-20 ℃骤升，Ilex cornuta 'Lutea-carpus'于0～-5 ℃大幅上升后趋稳，其余持续递增。以REC拟合Logistic方程得LT₅₀，Ilex opaca在测试温域内无拐点未算出LT₅₀；其余六种LT₅₀介于-22.6 ℃(Ilex × cassine，抗寒较强)至-11.9 ℃(Ilex cornuta 'Lutea-carpus'，抗寒较弱)，拟合R²为0.77～0.90。

3.2. Response of Osmotic Regulatory Substances to Low Temperature（渗透调节物质对低温的响应）：

SS、SP、Pro总体呈先升后降或渐增趋势。SS：Ilex dabieshanensis 5～-5 ℃显著升后-10 ℃始降；两冬青品种分别-10 ℃、-15 ℃达峰后降；Ilex × cassine、Ilex opaca、Ilex 'Nellie R.Stevens'随降温持续升(-20 ℃分别升63.02%、29.54%、48.12%)。SP：Ilex × 'China Girl'持续升；余者先升后降(Ilex dabieshanensis -10 ℃峰，另五者-15 ℃峰，-20 ℃回落)。Pro：Ilex × cassine持续升(-20 ℃峰)；余者先升后降(Ilex opaca与Ilex × 'China Girl' -15 ℃峰，其余-5 ℃峰后-20 ℃显著降)。

3.3. Response of Chloroplast Pigment Content to Low Temperature（叶绿体色素含量对低温的响应）：

除Ilex × 'China Girl'、Ilex dabieshanensis、Ilex cornuta 'Dwarf Burfordii'外，其余四种色素含量先升后降；几乎所有品种-20 ℃色素最低。Ilex dabieshanensis全期叶绿素总含量显著低于其他种。Chl a多数先升后降或渐降，-20 ℃均显著低于它温。Chl b变幅大于Chl a，Ilex dabieshanensis显著低。Car无一致温响规律，Ilex opaca显著高于它种。

3.4. Relationship Between Cell Membrane Permeability, Osmoregulatory Substances, and Chloroplast Pigments and Cold Tolerance（细胞膜透性、渗透调节物、叶绿体色素与抗寒性的关系）：

Pearson相关显示REC与MDA(r>0，p<0.01)、SP显著正相关，与Pro、Chl a、Chl b显著负相关；Chl a与Chl b显著正相关，与MDA、SS显著负相关；Chl b与Car、SS显著负相关，与Pro显著正相关；MDA与SS显著正相关。RF模型表明MDA(相对重要度31.4%)、Pro、Chl a共解释REC变异72.6%；Car、Chl b、SS合计仅14.38%。

讨论与结论总结：

讨论指出，细胞膜系是低温首要伤害位点，REC反映膜透性变化；Ilex opaca -20 ℃ REC仅27.61%，符合膜脂相变假说——较高不饱和脂肪酸比例可降低膜脂相变温度，维持低温下膜流动性。MDA为膜脂过氧化终产物，REC与MDA极显著正相关，Ilex opaca低温下MDA积累少暗示其膜脂不饱和脂肪酸可能偏高（需生化验证）。渗透调节方面，抗寒品种(Ilex opaca、Ilex × cassine、Ilex 'Nellie R.Stevens') SS与SP降幅小或持续升至更低温度，符合渗透保护功能；Pro于抗寒种Ilex × cassine -20 ℃增幅达98.16%，体现清除活性氧及维持渗透势作用（未测叶含水量，渗透调节物变化或部分受脱水浓缩影响）。叶绿体色素响应种间分化明显，Ilex × cassine 5～-15 ℃色素略升可能关联叶绿体结构适应，Ilex dabieshanensis色素快速降解或削弱光保护致光抑制敏感；MDA与Chl a、Chl b负相关，与REC正相关，提示膜脂过氧化、色素降解与膜透性增加协同发生。生理指标异步响应（渗透调节物先升后降 vs REC、MDA持续升）反映低温胁迫不同阶段——初期主动渗透调节维持膜稳，深低温(-10 ℃下)膜脂过氧化加剧超越调节能力。RF提示MDA、Pro、Chl a为核心抗寒关联指标；LT₅₀可作初筛但因Ilex opaca无测试温域拐点仅作定性参考，可靠抗寒评价需整合膜完整性、渗透调节及光合色素多指标。研究局限：离体叶无法反映整株抗寒驯化与田间越冬，急骤降温(0.8 ℃·min^?1)与短时处理仅模拟急性胁迫，所测为间接指标非存活率，结果为特定条件下初步生理初筛，需整株田间验证后方可支撑育种引种。

结论（翻译）：

本研究观察了七种常绿冬青离体叶片对急性低温胁迫的生理响应，供试品种间胁迫响应差异明显。其中Ilex opaca表现为-20 ℃下较低REC(27.61%)与MDA积累量，渗透调节物与光合色素水平相对稳定。相关与随机森林分析表明丙二醛(MDA)、游离脯氨酸(Pro)及叶绿素a(Chl a)与抗寒性相关联，三者共同解释相对电导率(REC)变异的72.6%；REC与MDA正相关、与Pro负相关，提示低温胁迫下膜脂过氧化程度、Pro水平与膜稳定性间存在内在联系。上述结果揭示了常绿冬青对急性低温胁迫的生理响应特征，并为初步评价其抗寒性提供了依据。