绿原酸对脱氧雪腐镰刀菌醇（DON）诱导的猪肺泡巨噬细胞铁死亡的影响

《Toxins》：Effects of Chlorogenic Acid on Deoxynivalenol (DON)-Induced Ferroptosis in Porcine Alveolar Macrophages

　　

脱氧雪腐镰刀菌醇（DON）是一种广泛存在于粮食作物和动物饲料中的霉菌毒素。其对猪的显著毒性对养猪业及人类健康构成严重威胁。该研究聚焦于铁死亡的两大核心特征——铁代谢与脂质过氧化，通过细胞实验及氧化脂质代谢组学方法，探讨绿原酸（CGA）对DON诱导的猪肺泡巨噬细胞（PAMs）铁死亡的影响。研究结果表明，DON通过改变铁转运相关蛋白（上调TFR1和DMT1，下调FPN1）破坏细胞内铁稳态，可能导致铁超载；同时，DON损伤谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）抗氧化轴（下调GPX4、SLC3A2、SLC7A11和GCLC），增加活性氧（ROS）水平，并使多种氧化脂质代谢物显著升高，与脂质过氧化增强一致，最终导致PAMs发生铁死亡。CGA通过恢复铁稳态、重建GPX4轴功能以减轻氧化应激，从而缓解上述效应。此外，CGA抑制脂质过氧化通路，尤其是亚油酸氧化代谢。综上所述，CGA能够保护PAMs并减轻DON的促铁死亡效应。

脱氧雪腐镰刀菌醇（DON）作为污染范围最广、超标率最高的霉菌毒素，对全球畜牧业及食品安全构成严峻挑战。猪对DON尤为敏感，其毒性可导致免疫细胞功能障碍，增加动物感染易感性并降低疫苗效价，故霉菌毒素中毒常被称为"潜在疾病"。铁死亡（ferroptosis）是一种铁依赖性的脂质过氧化驱动的程序性细胞死亡形式，近年来被发现参与多种霉菌毒素的毒性机制，但DON是否通过诱导猪肺泡巨噬细胞（PAMs）铁死亡发挥其细胞毒性，此前尚无研究报道。PAMs作为猪先天免疫系统的关键组成部分，是猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒及非洲猪瘟病毒等多种病原体的主要靶细胞，其功能状态直接影响猪的免疫防御能力。与此同时，现有脱毒方法如复合吸附剂、化学制剂、益生菌及光催化技术等，因成本高、残留毒性、营养损失及设备依赖等问题，实际应用受限。植物源性单体霉菌毒素拮抗剂成为防控霉菌毒素污染的重要策略，其中绿原酸（CGA）作为一种广泛存在于杜仲、金银花、甜菊、蒲公英及咖啡等植物中的多酚类化合物，具有广谱抗菌、抑制霉菌生长、抗氧化、减少ROS累积及免疫调节等多种生物学活性。前期研究表明CGA类化合物可调控铁死亡关键蛋白并部分抑制其发生，但CGA对DON诱导的PAMs铁死亡的影响及机制尚不明确。

该研究发表于《Toxins》，旨在揭示CGA对DON诱导PAMs铁死亡的保护作用及其分子机制，为养猪业中霉菌毒素污染的防控及农业养殖业的可持续发展提供理论依据。研究人员开展的研究主要包括：细胞活力检测、铁代谢相关蛋白及GPX4抗氧化轴蛋白表达的Western blot与ELISA检测、GSH含量测定、ROS检测、以及基于超高效液相色谱串联质谱（UPLC-MS/MS）的氧化脂质代谢组学分析。样本来源为上海酶联生物科技有限公司提供的3D4/21猪肺泡巨噬细胞系。

研究结果部分：

2.1 DON与CGA实验浓度的优化

研究人员采用CCK-8法检测细胞活力，确定DON对PAMs的半数抑制浓度（CC₅₀）为2.84 μM（0.84 μg/mL）。在此DON浓度下，8 μg/mL CGA处理使PAMs活力达到峰值并显著改善细胞存活（p < 0.01），该浓度被用于后续实验。

2.2 CGA对DON暴露PAMs中铁死亡关键蛋白表达的影响

2.2.1 铁代谢蛋白表达：Western blot与ELISA结果显示，DON显著上调PAMs细胞内转铁蛋白受体1（TFR1，90 kDa）和二价金属转运体1（DMT1，65 kDa）的表达（p < 0.0001），CGA显著拮抗此效应（p < 0.001）；DON显著下调膜铁输出蛋白1（FPN1，62–70 kDa）表达（p < 0.05），CGA则显著上调其表达（p < 0.01），恢复细胞内铁代谢平衡。

2.2.2 GPX4轴抗氧化系统及ROS含量：DON显著降低GPX4（20–23 kDa）、SLC7A11（35–40 kDa）、SLC3A2（67 kDa）和GCLC（72 kDa）的蛋白水平（p < 0.0001），显著减少谷胱甘肽（GSH）含量（p < 0.01），增加活性氧（ROS）水平；CGA显著逆转上述变化（p < 0.05或p < 0.0001），部分恢复抗氧化防御能力。

2.3 CGA对DON暴露PAMs氧化脂质代谢的影响

2.3.1 差异丰度代谢物筛选：氧化脂质代谢组学分析显示，与对照组相比，DON组有20种代谢物上调、6种下调，表明DON显著增加细胞内氧化脂质代谢物水平，促进脂质过氧化；而与DON组相比，DON+CGA组全部38种差异代谢物均下调，其中亚油酸（LA）、花生四烯酸（ARA）和二十二碳六烯酸（DHA）来源的代谢物占主导。两组比较共有的9种差异代谢物主要属于LA类别，包括9-HODE、13(S)-HODE、9,10-DiHOME、12(13)-DiHOME等。

2.3.2 KEGG通路富集分析：DON影响的代谢通路主要涉及亚油酸代谢、α-亚麻酸代谢、不饱和脂肪酸生物合成及整体代谢通路，其中6种差异代谢物映射至亚油酸代谢通路。值得注意的是，仅有1种差异代谢物（花生四烯酸，AA）被注释到铁死亡通路，但其Rich factor值为1，提示该代谢物在DON直接作用于铁死亡通路中的潜在意义。CGA调控的差异代谢物主要富集于整体代谢通路（12种）、亚油酸代谢通路和花生四烯酸代谢通路，表明CGA在氧化脂质代谢层面拮抗DON效应。

讨论部分，研究人员深入阐述了CGA抑制DON诱导PAMs铁死亡的分子机制。在铁代谢调控方面，DON通过上调TFR1和DMT1、下调FPN1促进Fe²⁺内流并抑制外排，导致细胞内铁超载，为铁死亡创造条件；CGA通过恢复这三种蛋白的正常表达，重建铁稳态，同时作为抗氧化剂限制ROS累积。在抗氧化系统方面，X_c^-/GSH/GPX4轴是哺乳动物抵御铁死亡的主要机制，其中溶质载体家族7成员11（SLC7A11）介导胱氨酸摄取，溶质载体家族3成员2（SLC3A2）维持系统X_c^-稳定性，谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基（GCLC）催化GSH合成起始步骤，而GPX4作为GSH依赖性过氧化物酶将脂质过氧化物还原为相应醇类以抑制铁死亡。DON显著抑制该轴多个组分的表达，削弱PAMs抗氧化防御；CGA则通过缓解DON对该轴的抑制，部分恢复ROS清除和抗脂质过氧化能力。研究人员特别指出，GCLC作为GSH合成的关键酶，其表达上调是CGA保护效应的重要环节。

在氧化脂质代谢层面，多不饱和脂肪酸（PUFAs）易在铁离子催化下发生脂质过氧化而促进铁死亡。DON通过增强亚油酸氧化代谢，生成大量羟基十八碳二烯酸（HODEs）、二羟基十八碳烯酸（DiHOMEs）和三羟基十八碳烯酸（TriHOMEs）等氧化产物。其中，9-HODE和13(S)-HODE由花生四烯酸15-脂氧合酶（ALOX15）及细胞色素P450（CYP）酶催化产生，直接生成脂质过氧化物并耗竭GSH，抑制GPX4活性；13(S)-HODE还可抑制过氧化氢酶（CAT）导致H₂O₂累积，加剧氧化应激。9,10-DiHOME和12(13)-DiHOME通过CYP途径产生，直接诱导氧化应激、损伤线粒体功能并增加脂质过氧化；后者还可影响T细胞分化，促进Th17细胞而抑制调节性T细胞（Tregs），间接破坏巨噬细胞功能微环境。TriHOMEs作为15-脂氧合酶（15-LOX）通路的产物，反映局部脂质过氧化进程，加重巨噬细胞代谢应激。此外，来源于ARA经环氧合酶-1（COX-1）途径的四去甲前列腺素F代谢物（Tetranor-PGFM）作为急性炎症标志物，与NF-κB炎症信号通路形成正反馈环路；而来源于DHA的20-HDHA和来源于α-亚麻酸（ALA）的13-HOTrE作为特异性促消退介质（SPMs）的前体或类似物，虽具有抗炎和促M2型巨噬细胞极化的补偿性作用，但在整体促炎/促氧化代谢网络中不足以逆转失衡。这些代谢物共同构成正反馈环路：DON激活CYP、ALOX15和COX-1等酶，产生大量HODEs、DiHOMEs和TriHOMEs，诱导氧化应激、抑制CAT、促进脂质过氧化，使巨噬细胞向促炎M1表型极化，持续释放ROS和炎症因子，同时DiHOMEs干扰T细胞分化、损害免疫调节，损伤相关分子模式（DAMPs）进一步激活周围免疫细胞，最终建立以氧化应激加剧、GPX4活性降低、炎症信号持续和免疫调节受损为特征的铁死亡微环境。

研究结论：该研究表明DON通过双重机制诱导PAMs铁死亡，即通过TFR1/DMT1/FPN1失调促进细胞内Fe²⁺超载，以及通过抑制X_c^-/GSH/GPX4轴和GCLC表达损害抗氧化能力。CGA通过恢复铁稳态、重建谷胱甘肽依赖性抗氧化系统有效拮抗DON诱导的铁死亡。脂质组学分析进一步揭示CGA减少来源于花生四烯酸、亚油酸和DHA的脂质过氧化物，并抑制亚油酸代谢通路。这些发现确立CGA为同时靶向铁代谢和氧化应激的铁死亡抑制剂，为其保护PAMs免受DON细胞毒性提供了机制基础，也为霉菌毒素毒性研究提供了新见解，并为开发基于CGA的畜禽DON相关疾病干预措施奠定了基础。