《Journal of Fungi》：Bioluminescence in the Edible Mushroom Hypsizygus marmoreus by Transformation with a Fungal Luciferase Gene
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在真菌生物发光途径（Fungal Bioluminescence Pathway, FBP）被阐明并被用作植物报告系统后，其在真菌中尚无应用记载。本研究首次通过在重要经济栽培菇类——斑玉蕈（Hypsizygus marmoreus，俗称真姬菇/鸿喜菇）中表达发
在真菌生物发光途径（Fungal Bioluminescence Pathway, FBP）被阐明并被用作植物报告系统后，其在真菌中尚无应用记载。本研究首次通过在重要经济栽培菇类——斑玉蕈（Hypsizygus marmoreus，俗称真姬菇/鸿喜菇）中表达发光真菌Neonothopanus nambi的荧光素酶（luciferase）基因nnLuz及其已报道的优化变体nnLuz-v4，建立了发光报告系统。研究人员利用已建立的农杆菌介导转化（Agrobacterium-mediated Transformation, ATMT）法，将野生型nnLuz基因及优化型nnLuz-v4分别导入H. marmoreus节孢子的基因组中，两基因均受H. marmoreus甘油-3-磷酸脱氢酶（Glycerol 3-phosphate dehydrogenase, GPD）基因启动子调控。添加外源荧光素（luciferin）后，携带野生型nnLuz的转化子产生清晰、易检测的生物发光信号，而未转化对照无发光现象。出乎意料的是，野生型荧光素酶表现出显著高于优化变体nnLuz-v4的发光强度，提示当供体与宿主亲缘关系较近（均为担子菌门Basidiomycetes）时，密码子优化（codon optimization）可能不必要甚至有害。该真菌荧光素酶基因在H. marmoreus中的成功部署提供了一种无需外部激发光的高灵敏度、非侵入性遗传工具，为启动子鉴定、子实体发育过程中基因表达的实时监测，以及旨在改良农艺性状的分子育种开辟了新途径。
通过转化真菌荧光素酶（luciferase）基因实现可食用斑玉蕈（Hypsizygus marmoreus）中的生物发光——论文解读
该研究论文发表于《Journal of Fungi》。
一、研究背景与立项依据
自然界中某些蘑菇菌丝或菌盖在夜间发出可见光的现象虽已被认知数百年，但其生化机制直至2018年才被完整阐明——Kotlobay等人揭示了真菌生物发光途径（Fungal Bioluminescence Pathway, FFP或FBP），明确了关键酶及真菌荧光素（fungal luciferin）的循环再生机制。随后，该途径被成功移植至植物中构建自主发光植物，作为报告系统（reporter system）得到广泛应用，且在2024年通过针对植物、酵母及哺乳动物的密码子优化（codon optimization）与定点突变获得了发光强度提升一到两个数量级的增强型真菌荧光素酶系统（如nnLuz-v4）。然而，尽管大多数食用菇（伞菌目Agaricales）与发光真菌（同属Agaricales）亲缘关系密切，至今尚无利用FBP作为食用菇遗传学报告系统的报道。目前食用菇研究中常用绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein, GFP）作为标记，但GFP需蓝光激发且依赖昂贵荧光显微镜，限制其便捷性与通量。斑玉蕈（Hypsizygus marmoreus）是我国大规模栽培的重要经济菇类，为开展基因功能与遗传调控研究，亟需一种灵敏、非侵入、无需激发光的示踪标记。基于此，研究人员利用实验室已建立的以节孢子（arthroconidia）为受体的农杆菌介导转化（Agrobacterium-mediated Transformation, ATMT）体系，将发光真菌Neonothopanus nambi的野生型荧光素酶基因nnLuz及其已发表之优化版本nnLuz-v4分别转化入H. marmoreus，评估其作为真菌内源报告系统的可行性及密码子优化在亲缘相近担子菌中的适用性。
二、主要关键技术方法
研究人员以实验室保存的H. marmoreus双核菌株HZ40为材料，以大肠杆菌DH5α进行质粒构建，农杆菌EHA105进行真菌转化。将野生型nnLuz及优化版nnLuz-v4克隆至双元载体pCAMBIA1300，由H. marmoreus甘油-3-磷酸脱氢酶（GPD）基因启动子驱动表达，以杏鲍菇（Pleurotus eryngii）来源羧噻隆抗性基因（carboxin resistance gene, CbxR）为筛选标记。采用ATMT法转化H. marmoreus节孢子，羧噻隆筛选获得转化子并经三轮继代验证有丝分裂稳定性。通过CTAB法提取基因组DNA，PCR鉴定外源基因整合情况。加入1 mmol/L外源荧光素后，使用配备Sony ICX694 CCD相机的Tanon 5200全自动化学发光成像系统采集发光信号，ImageJ量化发光强度，GraphPad Prism 9进行统计分析。
三、研究结果
3.1. The Wild-Type and Optimized Fungal Luciferase Genes Were Separately Transformed into H. marmoreus
研究人员将含nnLuz或nnLuz-v4的双元载体分别转化H. marmoreus节孢子，获得羧噻隆抗性菌落。经对代表性转化子基因组DNA进行PCR扩增（nnLuz预期片段457 bp，nnLuz-v4预期片段415 bp）及琼脂糖凝胶电泳检测，证实两种外源荧光素酶基因均已稳定整合至H. marmoreus基因组中，阴性对照野生型菌株未扩增出相应条带。
3.2. NnLuz Far Outperforms NnLuz-v4 in Luminescence Intensity
添加外源荧光素后，使用化学发光成像系统在不同曝光时间下检测。含nnLuz的转化子菌丝块仅需1秒曝光即可检测到发光信号，1分钟曝光可清晰显示整个菌丝表面稳定信号，20分钟曝光趋于饱和；野生型H. marmoreus即使曝光20分钟仍无信号。与之相反，本应在植物及酵母中显著增强发光的优化变体nnLuz-v4转化子在H. marmoreus中表现极差：1分钟曝光无信号，曝光20分钟仅能检测到微弱信号。ImageJ定量分析及GraphPad Prism统计显示，nnLuz转化子发光强度显著高于nnLuz-v4转化子，后者仅在长时曝光下勉强可测，证实在此亲缘相近担子菌宿主中野生型nnLuz催化活性远优于密码子优化版本nnLuz-v4。
四、讨论与结论总结（翻译并浓缩讨论部分核心结论）
研究人员指出，本研究首次在食用菇H. marmoreus中成功表达N. nambi来源的真菌荧光素酶基因nnLuz，所产酶具活性且可被CCD系统轻易检测，野生型背景无自发发光，证明真菌荧光素酶基因可作为栽培食用真菌中高灵敏度、自发光（无需激发光）的报告系统。意外发现是，在相同实验条件下野生型nnLuz序列的发光强度与信号产出均持续高于优化变体nnLuz-v4，这意味着当供体（N. nambi）与宿主（H. marmoreus）为系统发育上接近的担子菌门（basidiomycete）真菌时，密码子优化不仅无益甚至可能损害荧光素酶功能，推测天然密码子使用模式可能保留了共翻译折叠路径，对真菌荧光素酶正确折叠及酶活性至关重要。此外，不同于植物可经引入全套FBP四个基因实现底物咖啡酸（caffeic acid，木质素代谢产物）自循环而自发光的策略，食用菇未必具备充足的咖啡酸代谢库，故即便转入全部FBP基因也未必实现自发发光。萤萤光素酶（firefly luciferase）因种间差异大及潜在毒性在真菌中罕用，而源自担子菌的真菌荧光素酶更适用于食用菇；本研究中nnLuz及nnLuz-v4转化子与野生型生长无差异，表明无不良影响。该发光报告系统在H. marmoreus中的建立为食用菇遗传研究提供新工具：无需激发光源、无背景发光、可用简易低成本CCD检测，可用于启动子特征分析、不同发育阶段（菌丝生长、原基形成、子实体成熟）基因表达实时监测，以及构建响应环境或营养信号生物传感器，为加速产量、抗逆性及营养品质等农艺性状分子育种奠定基础。
