棘孢木霉(Trichoderma asperellum)与类棘孢木霉(T. asperelloides)：参与生物防治和生物肥料(B&B)活性基因的比较基因组研究

《Journal of Fungi》：Trichoderma asperellum and T. asperelloides: Comparative Genomic Study for Genes Implicated in Biocontrol and Biofertilizer Activities

　　

摘要：棘孢木霉(Trichoderma asperellum)和类棘孢木霉(T. asperelloides)是两种隐存种(cryptic species)，具有作为生物防治和生物肥料(biocontrol and biofertilizer, B&B)制剂的潜力。对两物种参考基因组的比对揭示各自均具7条染色体，但棘孢木霉比类棘孢木霉约多1000个基因。编码几丁质酶(chitinase)、纤维素酶(cellulase)、木聚糖酶(xylanase)、分泌型蛋白酶(secreted protease)及参与土壤与植物健康相关基因的数量，棘孢木霉略多于类棘孢木霉。此外，棘孢木霉比类棘孢木霉多5个参与合成肽类抗生素(peptaibol)和铁载体(siderophore)等次级代谢产物的基因。B&B相关基因分布于所有染色体上，所搜索的酶类未发现基因重复(duplicate gene)。研究还发现棘孢木霉核糖体DNA内转录间隔区(internal transcribed spacer, ITS)有15个拷贝，而类棘孢木霉仅7个拷贝。尚需进一步转录组、蛋白质组及效价研究，以确定类棘孢木霉中缺失的基因对其B&B活性相对于棘孢木霉的影响。由于类棘孢木霉基因组缺乏注释，对B&B基因的搜索仅限于在棘孢木霉基因组中搜寻B&B基因，并比对同源基因在类棘孢木霉中存在或缺失。需对两物种更多菌株进行比较，以验证本研究数据是否适用于两物种所有种内菌株。

《棘孢木霉与类棘孢木霉生物防治与生物肥料相关基因的比较基因组学研究》论文解读

研究背景与立题依据

木霉属(Trichoderma)广泛存在于土壤中，因其对植物病原真菌的拮抗作用（生物防治/biocontrol）及促进植物生长和健康（生物肥料/biofertilizer，合称B&B）而备受农业领域关注。传统化学农药带来的抗药性、环境污染及生态破坏推动了B&B制剂的研发，目前已有超过550种木霉被命名。其中棘孢木霉(T. asperellum)和类棘孢木霉(T. asperelloides)是由Samuels等人描述的两种隐存种(cryptic species)，形态无差异但可能存在活性、分布及宿主偏好不同；二者均常从土壤中被分离获得且在温热地区分布广泛，部分T. asperellum制剂已在欧洲上市。然而这两种近缘种谁的生防促生潜力更优尚不清楚，从基因组水平比较其B&B关键基因库有助于优良菌株筛选及加速木霉制剂开发。因此研究人员对两物种已完成染色体级别组装的参考基因组展开比较，重点分析编码细胞壁降解酶(cell wall-degrading enzymes, CWDEs)、非核糖体肽合成酶(nonribosomal protein synthetase, NRPS)、聚酮合酶(polyketide synthase, PKS)及PKS-NRPS融合基因、参与土壤改良与植物促生相关基因，并统计核糖体DNA内转录间隔区(internal transcribed spacer, ITS)拷贝数。

本研究发表于《Journal of Fungi》。

主要关键技术方法

研究人员选用NCBI中染色体水平组装的棘孢木霉T. asperellum strain FT101（ASM2064786v1，台湾土壤分离）与类棘孢木霉T. asperelloides strain X01119（ASM5208450v1，中国盐城土壤分离），使用NCBI Comparative Genome Viewer (CGV) 进行全基因组比对获同源染色体对应关系，用BLAST进行染色体序列相似性及基因同源比对（E值=0，覆盖度100%，相似度>95%判定为存在同源基因），用NCBI Genome Data Viewer (GDV) 按CAZy糖苷水解酶(Glycoside Hydrolase, GH)分类搜索几丁质酶、纤维素酶（含内切/外切葡聚糖酶、1,4-β-D-葡聚糖酶）、木聚糖酶及分泌蛋白酶编码基因，在棘孢木霉基因组中搜索NRPS/PKS/PKS-NRPS基因并核查GenBank记录确认铁载体(siderophore)合成相关域，同步搜索NADPH氧化酶、漆酶(laccase)、脲酶(urease)、酰基酯酶(acyl esterase)等土壤与植物健康相关基因；以Clustal Omega做多序列比对检验基因是否为重复拷贝；以模式菌株ITS序列（T. asperellum CBS 433.97，NR_130668.1）为Query BLAST全基因组获ITS rDNA串联重复拷贝数及染色体定位，并用MEGA构建ITS序列最大似然法(maximum likelihood)系统发育树。

研究结果

3.1. 棘孢木霉与类棘孢木霉基因组比较(Comparison of T. asperellum and T. asperelloides Genomes)

两基因组大小分别为37.3 Mb（12,041个基因）和36.9 Mb（11,096个基因），各含7条染色体，同源染色体序列同一性约95%，GC含量44.5%–48%。染色体1–4直接同源，染色体3序列方向相反（提交方向差异），T. asperellum 染色体5、6、7分别对应T. asperelloides 染色体6、7、5；染色体端区存在易位与倒位。结论：两物种核型高度同源但存在染色体重排及约1000个基因数目差异。

3.2. 编码裂解酶与次级代谢产物的基因(Genes Coding for Lytic Enzymes and Secondary Metabolites)

棘孢木霉基因组获22个GH18家族几丁质酶基因（分布于7条染色体，chr7含5个），类棘孢木霉缺2个（保有20个），各基因为单拷贝且无种内旁系同源。获15个纤维素酶/β-1,4-葡聚糖酶相关基因（GH多家族，分布于除chr3外染色体），类棘孢木霉缺1个（保有14个），亦无重复拷贝；其中5个为1,4-β-D-葡聚糖酶编码基因，缺失的那个即在此类。木聚糖酶获2个（GH10、GH11各1，分别位于chr6、chr3），类棘孢木霉均有同源基因。分泌蛋白酶获11个（分布全染色体），两物种完全一一对应（相似度93%–98%），无缺失。结论：B&B相关水解酶编码基因在两物种间高度保守，T. asperellum略多。

3.3. 编码NRPS、PKS和PKS-NRPS的基因(Genes Coding for NRPS, PKS, and PKS-NRPS)

棘孢木霉获54个NRPS/PKS/PKS-NRPS基因，类棘孢木霉缺5个（保有49个）。其中6个棘孢木霉基因具铁载体合成域，类棘孢木霉缺其中2个。土壤与植物健康相关基因（NADPH oxidase、laccase、urease、acyl esterase，共26个）两物种共享24个，类棘孢木霉缺1个NADPH oxidase基因和1个laccase基因（相似度91%–98%）。结论：T. asperellum次级代谢产物（含铁载体）合成基因簇稍多，促生相关基因高度保守。

3.4. 核糖体DNA内转录间隔区(Internal Transcribed Spacer (ITS) Region of rDNA)

棘孢木霉基因组含15个ITS拷贝，全定位于染色体7，8拷贝序列完全一致，其余7拷贝存在1–4个碱基缺口/差异；类棘孢木霉含7个ITS拷贝，全定位于染色体5，4拷贝序列一致，另3拷贝存在差异。基于Clonostachys rosea ITS根出的ML树显示T. asperelloides聚为较衍化支，T. asperellum为相对原始支。结论：T. asperellum具更高rDNA ITS串联重复拷贝数且ITS序列内部变异更多，两物种ITS定位染色体不同。

讨论与结论总结

讨论指出：两隐存种具约95%染色体序列同一性及相近核型，但T. asperellum总基因数多约1000个，且B&B关键基因（几丁质酶、部分纤维素酶/木聚糖酶、NRPS/PKS中参与peptaibol与siderophore合成的基因簇、个别促生基因）略占优势，类棘孢木霉缺失的2个siderophore合成相关基因可能影响其铁竞争及促生表现，需转录组/蛋白组/活体效价实验验证。ITS rDNA拷贝数T. asperellum（15拷贝）高于T. asperelloides（7拷贝）及其他参照木霉，且同一物种内ITS并非完全序列一致，建议系统发育研究关注全基因组ITS异质性。因只在T. asperellum注释基因组中正向搜索B&B基因、T. asperelloides未做反向搜索（缺注释），且比较基于各一株染色体级参考基因组，结论推广至全体菌株需更多染色体水平组装菌株验证；同种内两株T. asperellum染色体序列同一性达98%，结合T. asperelloides种内多样性更低之报道，认为本研究趋势或可延伸至两物种多数菌株。研究建议NCBI建立基于特征基因统一染色体编号与方向的提交规范。

结论翻译：本研究是首例专注木霉B&B活性基因的比较基因组研究，揭示隐存种间在全基因组及B&B相关基因数目上存在差异——T. asperellum总基因数更多且在生防相关基因上略多于T. asperelloides；差异的生物学意义需后续转录组、蛋白质组、核糖体生物发生、酶活性或生物效价研究阐明。所用方法仅需NCBI免费工具即可复现，可用于Harzianum Clade等其他隐存种鉴别；首次报道两隐存种ITS/rDNA拷贝数差异，其生物与系统发育意义待探。研究局限为T. asperelloides因缺注释未能反向搜索独特B&B基因，且GenBank缺两物种多株染色体水平注释基因组，亟需更多高质量木霉全基因组序列。