俄联邦莫斯科地区食用甜菜（table beet）采后贮藏期镰刀菌（Fusarium）腐烂的病原菌物种多样性

《Journal of Fungi》：Diversity of Fusarium Species Causing Storage Rot of Table Beet in the Moscow Region of the Russian Federation

　　

镰刀菌（Fusarium）真菌已知在世界范围内侵染各发育阶段的食用甜菜（Beta vulgaris subsp. vulgaris）植株。采后长期贮藏期间发生的镰刀菌根腐病（Fusarium root rot）具有突出的经济重要性。在俄罗斯，尚缺乏关于引起食用甜菜该病害的病原菌物种多样性的最新信息，这决定了本研究的目的。研究人员于2018年至2023年从俄联邦莫斯科地区种植的罹病甜菜根中共分离到28株镰刀菌（Fusarium）分离株。基于TEF-1α（翻译延伸因子1α）和RPB2（RNA聚合酶II第二大亚基）基因的系统发育分析结合形态学特征表明，参与贮藏期食用甜菜镰刀菌根腐病病原过程的共有5种镰刀菌（Fusarium）：尖刀镰刀菌（Fusarium acuminatum，占总分离株数的43%）、燕麦镰刀菌（Fusarium avenaceum）、Fusarium campestre（FTSC）；拟枝孢镰刀菌（Fusarium sporotrichioides，FSAMSC）和腐皮镰刀菌（Fusarium solani，FSSC）。同时，尖刀镰刀菌（F. acuminatum）、Fusarium campestre和拟枝孢镰刀菌（F. sporotrichioides）为首次在俄联邦甜菜根上发现。研究人员在5 °C和25 °C下研究了鉴定物种的温度敏感性。根据营养培养基和天然基质上的冷耐受指数（cold tolerance index，CTI）值，分离株的分布顺序分别为：Fusarium campestre（0.32）>尖刀镰刀菌（F. acuminatum，0.22）>燕麦镰刀菌（F. avenaceum，0.21）>拟枝孢镰刀菌（F. sporotrichioides，0.19）>腐皮镰刀菌（F. solani，0.20）和尖刀镰刀菌（F. acuminatum，0.32）>Fusarium campestre（0.21）>腐皮镰刀菌（F. solani，0.03）>燕麦镰刀菌（F. avenaceum）与拟枝孢镰刀菌（F. sporotrichioides，0.01）。这证实了需要在不同温度条件下于天然基质（寄主植物）上研究分离株致病特性的必要性。当接种优势且侵染力最强的尖刀镰刀菌（F. acuminatum）时，在两个温度条件下（5 °C时Va＝2–8 mm3，25 °C时Va＝31–1760 mm3），受害面积大小因品系基因型不同而产生高度变异。因此，该物种可被视作评估食用甜菜根对镰刀菌腐烂抗性的最具客观性的区分因子，这决定了在其育种过程中有必要将其纳入，以培育适于俄罗斯中部地区的抗病品种和杂交种。本研究获得的数据对制定与贮藏期甜菜镰刀菌（Fusarium）腐烂相关的镰刀菌（Fusarium）真菌管理策略具有重要意义。研究结果也对其他需长期保鲜或在低温下进行种子生产春化（vernalization）的蔬菜作物具有参考价值。

该研究论文发表于《Journal of Fungi》。研究背景方面，食用甜菜（table beet，Beta vulgaris subsp. vulgaris）是俄联邦具有重要战略意义的蔬菜作物，其在生长期和根贮藏期均易受多种真菌及细菌病原侵染，其中镰刀菌（Fusarium）根腐病（root rot）在采后长期贮藏期间造成的经济损失尤为突出。已有文献显示，国际上关于甜菜镰刀菌根腐病的物种组成曾有零星报道，但在俄联邦范围内，长期以来缺乏基于分子系统发育的 updated 物种多样性数据与致病力评估，既往鉴定仅依赖形态学，存在局限。同时，贮藏后期温度变动（2–6 °C）下不同镰刀菌物种的温度适应性及其在天然寄主上的致病表现尚不明确，这制约了抗病育种与病害管理策略的制定。为此，研究人员以俄联邦莫斯科地区为研究区域，在2017–2023年间开展甜菜贮藏期镰刀菌腐烂的病原物种组成解析、温度敏感性评价及寄主抗性筛选研究，旨在明确病原复合体（pathocomplex）的物种多样性、优势种致病特征及对温度的响应，为抗病育种和病害防控提供依据。

主要关键技术方法包括：样本来源于2017–2023年种植于莫斯科地区联邦蔬菜中心试验田的食用甜菜品种/品系，采收后按标准技术贮藏于2–6 °C、湿度90–92%的蔬菜贮藏设施，每年贮藏期结束后进行植物病理学监测与罹病根采样；真菌分离采用表面消毒后置于PDA和Czapek-Dox培养基培养，获得单孢子纯分离株；分子鉴定选取ITS、tef1（翻译延伸因子1α编码基因）和rpb2（RNA聚合酶II第二大亚基编码基因）位点进行PCR扩增与测序，在GenBank和FUSARIOID-ID数据库比对，并用最大似然法（Maximum Likelihood，Tamura-Nei模型）构建系统发育树；形态学鉴定在PDA上26天交替光照25 °C条件下观察菌落宏观特征与产孢结构（分生孢子、厚垣孢子等），测量至少30–40个显微结构；致病力测定采用根盘人工接种菌丝块法，在25 °C和5 °C下评估受害体积（Va，按圆柱体积计算半径与深度），划分非致病、弱侵染、中等侵染、强侵染等级；温度敏感性通过冷耐受指数（CTI＝低温下生长指标/25 °C下生长指标）评价，分别在PDA培养基和甜菜根盘天然基质上测定5 °C与25 °C菌落直径或受害面积；数据统计用Excel和Statistica 10.0做ANOVA及Duncan多重范围检验（p≤0.05）。

研究结果如下：

3.1. Phytopathological Monitoring and Symptoms（植物病理学监测与症状）：通过对2018–2023年贮藏期甜菜根的监测，镰刀菌腐烂发生率年为23%（2020）至58%（2023），病情指数（DSI）平均1.8–2.4点；温暖干燥年份植被期水文系数（HTC）低（0.8–1.0）时发生率更高，提示生育期缺水与高温降低植株免疫状态从而促进贮藏期发病。症状定位统计显示33%为表面溃疡伴灰白孢子层，30%为根头腐烂（有时全头崩解、内部干腐空腔），15%仅内部组织/导管腐烂（外表无伤），15%全根腐烂（DSI 3.5–4），7%为根尖/主轴根干腐且不扩展；2018–2019年以根头病灶为主（35–50%），2020–2023年表面溃疡比例升至30–60%，根头病灶降至10–32%，反映不同年份病原侵染模式变化。

3.2. Isolation of Fusarium Isolates Associated with Storage Rot of Table Beet and Assessment of Their Aggressiveness（甜菜贮藏腐烂相关镰刀菌分离株分离与侵染力初评）：共获得28株用于研究（总分离32株），初步人工接种下54%分离株为中等侵染力（MA，Va＝71–150 mm³），18%为强侵染力（HA，Va≥151 mm³）。

3.3. Phylogenetic Analysis of Fusarium Fungi（镰刀菌系统发育分析）：基于tef1和rpb2（部分也测ITS）序列与FUSARIOID-ID参比序列聚类，确定5个物种：尖刀镰刀菌（F. acuminatum，FTSC，镰刀菌三隔种复合体，Fusarium tricinctum species complex）、燕麦镰刀菌（F. avenaceum，FTSC）、Fusarium campestre（FTSC）、拟枝孢镰刀菌（F. sporotrichioides，FSAMSC，Fusarium sambucinum species complex）、腐皮镰刀菌（F. solani，FSSC，Fusarium solani species complex）；其中尖刀镰刀菌占43%，其余各约14%；尖刀镰刀菌、Fusarium campestre、拟枝孢镰刀菌为俄联邦甜菜上首次记录。

3.4. Morphology of Strains of Identified Fusarium Species（鉴定镰刀菌种菌株的形态学）：在PDA 25 °C交替光照26天条件下，不同种在气生菌丝密度、基质色素、产孢结构上差异明显；所有种均产大小分生孢子，仅拟枝孢镰刀菌与腐皮镰刀菌产生厚垣孢子（chlamydospores）；显微尺寸测量符合各物种已知范围。

3.5. Aggressiveness of Fusarium Species for Different Varieties of Table Beet Based on In Vitro Artificial Inoculation of Root Disks（基于根盘人工接种的不同甜菜品种对各镰刀菌种的侵染力）：尖刀镰刀菌平均受害体积435 mm³，显著大于其他种（腐皮镰刀菌303 mm³，其余更低；燕麦镰刀菌与对照无显著差异），且尖刀镰刀菌引起内部组织破坏、空腔和白菌丝层；腐皮镰刀菌品种特异性明显（某些品种损伤显著）；双因素方差显示镰刀菌物种效应占45%、物种×品种互作占47%、品种基因型效应占8%。

3.6. In Vitro Growth of Fusarium Species on Artificial Nutrient Media at Different Temperatures（不同温度下镰刀菌种在人工培养基上的体外生长）：25 °C时尖刀镰刀菌与拟枝孢镰刀菌生长最快（~0.7 cm/天，13天满皿），燕麦镰刀菌最慢（0.2 cm/天，26天53 mm）；5 °C时所有种有滞后期6–8天，之后缓慢生长，26天时菌落直径为25 °C的1.5–2倍更小；CTI（培养基上）排序为Fusarium campestre（0.32）>尖刀镰刀菌（0.22）>燕麦镰刀菌（0.21）>拟枝孢镰刀菌（0.19）>腐皮镰刀菌（0.20）；25 °C下7–19天起显物种特异性色素，5 °C下无色素。

3.7. In Vitro Growth of Fusarium Species on a Natural Substrate (Beet Root Discs) at Different Temperatures（不同温度下镰刀菌种在天然基质甜菜根盘上的体外生长）：25 °C下尖刀镰刀菌平均受害体积663 mm³（31–1760 mm³），其余种5–21 mm³，差异显著；5 °C下燕麦镰刀菌与拟枝孢镰刀菌几乎不发展（0–1 mm直径），尖刀镰刀菌仍保持最高（平均4.5 mm³，范围0.7–8 mm³），腐皮镰刀菌与Fusarium campestre也降低至0.3–4.5 mm³；CTI（根盘上）排序为尖刀镰刀菌（0.32）>Fusarium campestre（0.21）>腐皮镰刀菌（0.03）>燕麦镰刀菌与拟枝孢镰刀菌（0.01），与培养基上排序不同，说明人工培养基结果不能直接外推天然基质。

3.8. The Effect of Pathogen Species, Temperature, Substrate Type, and Plant Genotype on the Development and Pathogenic Properties of Fusarium Fungi（病原物种、温度、基质类型和植物基因型对镰刀菌发育与致病属性的影响）：病原物种因子解释受害严重度变异的25–80%，温度为培养基上线虫生长变异的主因子（达80%），但对根盘致病力的作用是经由物种×温度互作介导（10–12%）；植物基因型主效仅2–5%，但通过三重互作（基因型×物种×温度）显现，尤其尖刀镰刀菌下基因型贡献可达10%；温度降低时培养基生长与根盘致病变异的相关性由25 °C的r=0.23升至5 °C的r=0.72；物种间致病力排序在25 °C与5 °C间维持相关（r=0.85）；未发现对所有镰刀菌种普遍的抗性，但有交叉反应组：Fusarium campestre/腐皮镰刀菌（r=0.75–0.85），燕麦镰刀菌/拟枝孢镰刀菌（r=0.62）；尖刀镰刀菌的侵染力与其他种相关性弱。

讨论部分总结：研究人员指出，镰刀菌可 worldwide 侵染甜菜各阶段，贮藏期根腐病可致50%以上产量损失；莫斯科地区近年镰刀菌成为贮藏腐烂复合体的主导成分，发生率最高58%，这与植被期高温低湿（低HTC）下植株免疫下降有关。过去俄联邦甜菜镰刀菌物种信息仅来自20世纪末形态学鉴定，本研究首次用tef1+rpb2分子系统发育结合形态学明确了5个种，其中尖刀镰刀菌、Fusarium campestre、拟枝孢镰刀菌为俄联邦甜菜首次记录，尖刀镰刀菌为优势种（43%）且侵染力最强，腐皮镰刀菌次之但品种特异性明显，燕麦镰刀菌侵染力弱。温度实验显示，人工培养基上的冷耐受指数（CTI）与天然基质（根盘）上不同，如Fusarium campestre在培养基CTI最高（0.32）但在根盘上低于尖刀镰刀菌（0.21 vs 0.32），说明必须用天然基质评价致病相关的温度适应性；尖刀镰刀菌虽在5 °C下绝对侵染力下降，但仍显著高于其他种，且在两种温度下均能较好侵染，故它是评价甜菜抗镰刀菌根腐病最客观的区分因子，应纳入育种程序；某些品系（如208、210）在两种温度下受害体积均低，可能是抗尖刀镰刀菌等种的遗传源。基因型效应主要通过与物种×温度互作体现，低温下部分品系抗性表现与25 °C不一致，强调育种需多温度评价。尖刀镰刀菌也在莫斯科地区其他蔬菜（洋葱、胡萝卜）贮藏腐烂中分离且侵染力强，提示蔬菜轮作中可能存在跨寄主风险，需研究其交叉致病性以优化轮作。结论部分翻译：该研究提供了俄联邦莫斯科地区条件下引起食用甜菜贮藏期镰刀菌腐烂的镰刀菌（Fusarium）真菌生物多样性与致病性的新见解。基于TEF-1α和RPB2基因的系统发育分析结合形态学特征明确了分类归属，鉴定出5种镰刀菌：尖刀镰刀菌（F. acuminatum）、燕麦镰刀菌（F. avenaceum）、Fusarium campestre（FTSC）、拟枝孢镰刀菌（F. sporotrichioides，FSAMSC）和腐皮镰刀菌（F. solani，FSSC）；尖刀镰刀菌为复合体优势种（43%），其余各约14%。研究人员首次报道了尖刀镰刀菌对该寄主在俄联邦的高致病性。研究确定尖刀镰刀菌（相对耐低温）是两种温度下评估甜菜根对镰刀菌腐烂抗性的基因型区分因子。育种品系208和210在两种温度下平均受害值均低，可能代表了对尖刀镰刀菌、燕麦镰刀菌、Fusarium campestre、拟枝孢镰刀菌、腐皮镰刀菌复合体具遗传群体抗性。数据对制定甜菜根镰刀菌腐烂管理策略及其他长期保鲜蔬菜或低温种子生产（春化）病害防控有重要意义。