线粒体蛋白UPS1调控白色念珠菌致病性的作用

《Journal of Fungi》：The Role of Mitochondrial Protein UPS1 in Regulating Pathogenicity of Candida albicans

　　

线粒体膜蛋白UPS1是酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中一种保守的线粒体膜间隙蛋白，具有磷脂酸（PA）转运活性，并在线粒体心磷脂（CL）代谢与转运等过程中发挥正向调控作用。UPS1蛋白在线粒体相关致病真菌中的功能，尤其是其对菌丝生长和生物被膜形成等白色念珠菌（Candida albicans）关键毒力因子的影响，尚未得到研究。研究人员采用基因敲除技术、线粒体功能分析以及菌丝与生物被膜发育检测，研究了UPS1蛋白在白色念珠菌中的功能。结果显示，UPS1基因缺失可导致线粒体形态改变、活性氧（ROS）水平升高以及胞内三磷酸腺苷（ATP）含量降低，从而引起白色念珠菌严重的生长缺陷。此外，转录组分析表明，UPS1缺失显著抑制了与菌丝生长和生物被膜形成相关基因的表达。功能实验进一步证实，UPS1缺陷显著损害白色念珠菌的细胞黏附能力、菌丝发育及生物被膜形成。值得注意的是，UPS1蛋白缺失明显降低了白色念珠菌对靶向细胞膜抗真菌药物的敏感性。最后，利用大蜡螟（Galleria mellonella）幼虫感染模型和小鼠外阴阴道念珠菌病模型证实，UPS1基因敲除可减弱白色念珠菌的致病性。综上，研究结果表明，UPS1蛋白通过调控线粒体功能、菌丝生长和生物被膜形成来调节白色念珠菌的致病性。

该文发表于《Journal of Fungi》，聚焦线粒体脂质转运相关蛋白UPS1在线粒体稳态与白色念珠菌致病性之间的联系。白色念珠菌是常见条件致病真菌，在宿主免疫受损、菌群失衡等情况下可由共栖状态转变为侵袭性感染状态。其致病过程高度依赖形态转换、黏附、菌丝形成和生物被膜构建等毒力特征，而这些过程又与线粒体介导的能量代谢、氧化应激适应和环境应答密切相关。既往研究已提示线粒体蛋白质量控制、线粒体锚定及呼吸功能失衡会影响白色念珠菌毒力，但作为线粒体膜间脂质转运家族成员的UPS1，在该菌中的具体作用长期不清楚。由于UPS1在酿酒酵母中参与磷脂酸（PA）向线粒体内膜（IMM）转运并促进心磷脂（CL）合成，因此阐明其在白色念珠菌中的功能，对于理解机会致病真菌如何借助线粒体脂质稳态维持毒力具有重要意义。

围绕这一科学问题，研究人员构建了UPS1纯合缺失株ups1?/?及回复株ups1?/?: UPS1，系统考察其在线粒体功能、碳源利用、温度适应、菌丝形成、生物被膜发育、药物应答和体内感染中的作用。研究结果表明，UPS1定位于线粒体，并且对维持线粒体稳态具有关键作用。UPS1缺失后，菌体出现明显的线粒体碎片化，线粒体膜电位（MMP）下降，胞内ATP显著减少，同时活性氧（ROS）异常积累，提示线粒体结构与呼吸功能均受到实质性损害。在此基础上，突变株表现出显著生长迟缓、倍增时间延长，以及对非发酵碳源利用能力下降，尤其在较高温度下呼吸代谢缺陷更加突出，说明UPS1参与支撑白色念珠菌对宿主环境的代谢适应。

研究所采用的主要技术方法包括：利用HIS1-LEU2-ARG4营养缺陷筛选系统结合CRISPR-Cas9构建UPS1缺失株与回复株；通过UPS1-mNeonGreen与MitoTracker Red共定位、JC-1染色、ATP定量、ROS荧光检测等方法评估线粒体定位与功能状态；采用RNA-seq（转录组测序）联合qRT-PCR分析差异表达基因；通过液体和固体诱导培养、XTT还原实验、CFW染色与共聚焦显微成像评价菌丝、生物被膜和黏附表型；并使用大蜡螟幼虫感染模型及C57BL/6小鼠外阴阴道念珠菌病（VVC）模型验证体内致病性，同时检测阴道灌洗液真菌负荷及炎症因子转录和蛋白水平。

在结果部分，论文首先以“C. albicans UPS1 Exerts a Critical Role in Mitochondrial Homeostasis”为题，说明UPS1在线粒体稳态中的核心作用。研究人员通过荧光共定位证实UPS1与线粒体信号高度重叠，表明其在线粒体中发挥功能。随后借助Mito-Tracker Red和JC-1实验发现，ups1?/?突变株发生明显线粒体碎裂，红/绿荧光比值下降，提示线粒体膜电位显著去极化。流式细胞术与定量荧光分析进一步支持该结论。与此同时，UPS1缺失导致ATP水平大幅降低、ROS明显升高，而回复株均表现出不同程度恢复。这一部分明确表明，UPS1是维持线粒体结构完整性、膜电位稳定和能量代谢平衡所必需的关键因子。

在“UPS1 Deficiency Impacted C. albicans Growth”部分，论文进一步将线粒体功能缺陷与生长适应性联系起来。通过发酵性与非发酵性碳源培养、不同温度条件比较以及生长曲线分析，研究人员发现ups1?/?在多种培养基上均表现出生长受限，其中在以甘油、乙醇等非发酵碳源为主的条件下缺陷尤为显著，且随温度升高而进一步恶化，37 °C时几乎无法正常生长。液体培养中，突变株OD₆₀₀上升速度减慢，倍增时间显著延长。应激敏感性实验显示，UPS1缺失并未明显增加对白细胞壁应激剂刚果红和Calcofluor White的敏感性，但对氟康唑、两性霉素B及十二烷基硫酸钠等膜相关应激表现出一定耐受，提示UPS1还与膜稳态和药物反应调控相关。

在“Transcriptomic Analysis of UPS1 Function”部分，研究人员利用RNA-seq揭示UPS1缺失的分子后果。与野生型相比，ups1?/?中共有163个基因上调、40个基因下调。GO富集分析显示，这些差异基因主要涉及线粒体蛋白靶向、线粒体DNA复制、呼吸代谢、核糖体组分、生物大分子复合体以及应激和代谢稳态等过程，进一步支持UPS1在线粒体功能维持中的重要性。热图分析同时显示，多种与线粒体功能、菌丝形成、细胞壁构建、生物被膜形成及药物耐受有关的基因表达发生改变。qRT-PCR验证发现，毒力相关基因ECE1、ALS1和ALS3在UPS1缺失株中显著下调，而唑类药物靶基因ERG11显著上调；在菌丝诱导条件下，ALS3和ECE1下调更为明显。这些结果从转录调控层面提示UPS1与黏附、菌丝发育、生物被膜形成以及药物敏感性密切相关。

在“The Absence of UPS1 Hinders Hyphal Development, Adhesion, and Biofilm Formation in C. albicans”部分，研究人员对UPS1缺失株的关键毒力表型进行了直接验证。在RPMI-1640、YPD + 10% FBS、Lee’s、Spider和SLAD等多种诱导条件下，野生型可形成明显伸长的极性菌丝，而ups1?/?仅形成短小假菌丝或维持酵母样形态，显示严重的菌丝形成障碍。固体培养基上，突变株菌落直径缩小，边缘无法形成正常放射状菌丝。体外黏附实验显示其表面黏附能力明显下降。XTT实验、CFW荧光成像及三维共聚焦观察进一步表明，UPS1缺失显著削弱生物被膜形成能力，表现为被膜密度下降、厚度减小。由此可见，UPS1通过维持线粒体功能，间接支持白色念珠菌完成从黏附到菌丝再到被膜成熟的一系列致病关键步骤。

在“Abrogation of the UPS1 Gene Causes a Marked Decrease in the Pathogenicity of C. albicans”部分，论文使用体内模型验证UPS1对真实感染能力的影响。于大蜡螟幼虫模型中，野生型感染可迅速导致宿主死亡，而ups1?/?感染组幼虫生存率明显提高，且体内真菌负荷显著降低，回复株则恢复较高毒力。小鼠外阴阴道念珠菌病模型进一步证明，UPS1缺失会减轻局部炎症和组织损伤。与野生型相比，ups1?/?感染组小鼠阴道口红肿与溃疡较轻，HE染色显示黏膜结构破坏和炎性细胞浸润减少；阴道灌洗液革兰染色显示真菌附着和菌丝形成减弱；培养计数证实真菌负荷下降。炎症因子检测表明，UPS1缺失组促炎因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）水平下降，而抗炎因子白细胞介素-10（IL-10）相对升高，qRT-PCR与酶联免疫吸附测定（ELISA）结果一致。这些数据共同说明，UPS1是白色念珠菌建立宿主感染和诱发炎症反应的重要调控因子。

讨论部分将UPS1置于白色念珠菌线粒体调控网络中加以审视。研究认为，UPS1作为线粒体脂质转运蛋白，可能通过介导PA转运和CL合成来维持线粒体膜结构与呼吸链功能，从而影响能量供应、氧化还原平衡、环境适应和毒力因子表达。与既往研究的OCT1和NUM11相比，UPS1同样通过线粒体稳态影响致病性，但其在药物耐受调节方面呈现更突出的特征，尤其与ERG11上调及唑类耐受增强相关。作者也指出，本研究尚未完全阐明UPS1缺失导致CL合成障碍后如何具体传导至呼吸链异常，也未彻底解析其对ERG11调控是直接还是间接发生。此外，感染模型和药物种类仍有限，UPS1与其他线粒体调控蛋白之间的关系亦有待深入研究。

研究结论可概括为：UPS1是白色念珠菌中的关键线粒体调控蛋白，其缺失会造成线粒体结构和功能严重失衡，表现为膜电位下降、ATP生成减少及ROS积累，并进一步削弱碳源利用、生长增殖、菌丝形成、黏附与生物被膜发育。同时，UPS1缺失降低了白色念珠菌在大蜡螟和小鼠外阴阴道感染模型中的毒力与定植能力。总体而言，UPS1通过调控线粒体功能将代谢适应、应激反应与毒力表达整合起来，是理解白色念珠菌致病机制和开发新型抗真菌干预策略的重要分子靶点。