内生真菌球孢黑孢霉(Nigrospora sphaerica)对五彩秋海棠炭疽病的生物防治与促生潜力

《Journal of Fungi》：Biological Control and Growth-Promoting Potential of the Endophytic Fungus Nigrospora sphaerica Against Anthracnose in Begonia benariensis

　　

为了探索高效且可持续的防治五彩秋海棠(Begonia benariensis)炭疽病的生防资源，研究人员从健康宿主组织中分离内生真菌，并筛选其对Colletotrichum aotearoa SWBG5的拮抗活性。在31株分离物中，4株表现出强抑制效果，其中最强菌株QYN6的体外菌丝抑制率达63.67%。基于形态学和多基因系统发育（ITS、TUB2、TEF-1α），QYN6被鉴定为球孢黑孢霉(Nigrospora sphaerica)。机制分析表明，QYN6分泌多种细胞壁降解酶（cell wall-degrading enzymes, CWDEs：几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶、纤维素酶、蛋白酶），并对病原菌菌丝表现出重寄生现象（缠绕、变形、肿胀），协同作用抑制真菌生长。在温室盆栽试验中，QYN6对秋海棠炭疽病的生防效果达48.91%。此外，QYN6显著激活宿主防御反应，提高抗氧化酶（超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、过氧化氢酶(CAT)）活性以及可溶性蛋白和可溶性糖含量。进一步地，QYN6表现出多种植物促生特性，包括IAA产生、铁载体合成和钾溶解。接种QYN6显著提高了五彩秋海棠的株高、叶数、根长和生物量。总之，球孢黑孢霉QYN6具有双重生防和促生潜力，为秋海棠炭疽病的绿色管理提供了有前景的微生物资源和理论基础。

五彩秋海棠（Begonia benariensis）是一种观赏价值极高的多年生草本花卉，但其炭疽病（由Colletotrichum属真菌引起）严重危害茎叶，降低观赏性和经济价值。目前系统研究不足，传统防治方法存在局限性。因此，研究人员致力于从内生真菌中筛选高效可持续的生防资源。本研究从健康五彩秋海棠组织中分离内生真菌，筛选出强拮抗菌株QYN6，鉴定为球孢黑孢霉（Nigrospora sphaerica），并系统评估了其对炭疽病原菌Colletotrichum aotearoa SWBG5的生防机制、诱导抗性及促生潜力。研究发现QYN6分泌多种细胞壁降解酶并表现重寄生作用，在温室盆栽中生防效率达48.91%；同时显著提升宿主抗氧化酶活性和渗透调节物质含量，并表现出产吲哚乙酸（IAA）、铁载体和溶钾等促生特性，有效促进植株生长。该研究为秋海棠炭疽病的绿色防控提供了候选微生物资源和理论依据，论文发表在《Journal of Fungi》。

研究人员采用的主要关键技术方法包括：1）组织分离法从五彩秋海棠根茎叶分离内生真菌；2）对峙培养法测定抑菌率并筛选目标菌株；3）形态学观察结合多基因系统发育分析（ITS、TUB2、TEF-1α）进行菌种鉴定；4）显微观察重寄生现象；5）平板透明圈法结合比色法定性定量检测细胞壁降解酶（几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶、纤维素酶、蛋白酶）活性；6）体外离体叶片和温室盆栽法评估生防效果（植株购自广东佛山南海金彩蝶园艺有限公司，病原菌SWBG5由西南林业大学实验室保藏）；7）分光光度法测定防御酶（SOD、POD、PPO、CAT）活性及可溶性蛋白、可溶性糖含量；8）平板法和比色法检测溶磷、溶钾、产铁载体和IAA能力；9）生长指标（株高、叶数、根长、鲜重、干重）测定。

**3.1. 内生真菌的抑菌效果**：通过对峙培养，从31株分离物中筛选出4株对SWBG5具有强拮抗活性的菌株（QJN4、QYN6、QYN9、QYN12），其中菌株QYN6抑菌率最高，达63.67%。

**3.2. QYN6的鉴定**：形态学观察显示QYN6菌落特征（白色渐变为灰黑色，分生孢子暗褐色无隔）初步确定为Nigrospora属；分子鉴定基于ITS、TUB2、TEF-1α多基因系统发育树，QYN6与N. sphaerica GUCC 191020聚于同一分支（自展值99%），综合鉴定为球孢黑孢霉（Nigrospora sphaerica）。

**3.3. QYN6的重寄生现象观察**：显微镜下发现QYN6与病原菌对峙接触72 h后，病原菌丝出现变形、折叠、溶解、断裂、弯曲及局部肿胀，表明QYN6对SWBG5具有重寄生作用。

**3.4. QYN6产生的细胞壁降解酶（CWDEs）结果**：平板定性检测显示β-1,3-葡聚糖酶、纤维素酶和蛋白酶形成明显透明圈，几丁质酶未见明显透明圈；但定量测定确认QYN6能分泌四种酶，其中β-1,3-葡聚糖酶活性最高（691.54 U·mL^?1），其次为蛋白酶（233.29 U·mL^?1）、纤维素酶（160.77 U·mL^?1）和几丁质酶（70.85 U·mL^?1）。

**3.5. 菌株QYN6的生防效果**：离体叶片试验中，QYN6处理后发病指数为41.67（对照72.22），生防效率42.69%；温室盆栽试验中，处理组发病指数16.25（对照31.81），生防效率48.91%，证实QYN6具有一定生防潜力。

**3.6. QYN6对植物的诱导抗性**：与对照（CK）和单接种病原菌（CA）相比，QYN6单施及QYN6+CA联合处理均显著提高叶片SOD、POD、PPO、CAT活性及可溶性蛋白和可溶性糖含量。其中SOD和POD活性呈先降后升的双峰变化，可溶性蛋白和可溶性糖峰值分别达CK组的1.54倍和1.37倍，表明QYN6通过激活防御酶和积累渗透调节物质增强宿主抗病性。

**3.7. QYN6的促生功能检测及其对植物生长的影响**：
- **3.7.1. 促生功能检测结果**：QYN6在有机磷卵黄培养基上形成透明圈（具有机磷溶解能力）；在钾溶解检测板中菌丝向钾长石粉生长并覆盖（强钾溶解能力）；在CAS平板上产生大量铁载体（降解蓝色复合物形成棕色晕圈）；IAA分泌测定显色接近紫色，定量测定IAA含量为21.91 μg·mL^?1。
- **3.7.2. 菌株QYN6对五彩秋海棠生长的影响**：灌根处理30天后，QYN6处理组的株高增量、叶数增量、根长、地上部鲜重与干重、根部鲜重与干重均显著高于对照组，表明QYN6对植株生长具有积极促进作用。

讨论部分总结：研究人员指出，内生真菌QYN6通过营养空间竞争、重寄生及分泌CWDEs协同抑制病原菌；菌株对宿主无致病性，安全性良好。防御酶活性动态变化反映内生菌建立过程中宿主免疫的暂时抑制与后期系统抗性激活。促生方面，QYN6通过溶磷、溶钾、产铁载体和IAA改善植物营养与生长。盆栽生防效果（48.91%）略高于离体叶片（42.69%），归因于完整植株的诱导系统抗性（ISR）与促生功能的协同作用。结论部分翻译如下：

**5. 结论**：菌株QYN6产生多种细胞壁降解酶，包括几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶、纤维素酶和蛋白酶，通过破坏细胞壁结构有效抑制病原菌生长。其对五彩秋海棠炭疽病的防治效率达48.91%。同时，QYN6在磷溶解、钾释放、铁载体产生和IAA分泌方面表现出优异的植物促生性能，显著提高了株高、叶数、根长和生物量。此外，QYN6通过提高叶片抗氧化酶（SOD、POD、CAT和PPO）活性显著增强植物抗病性。总之，QYN6具有突出的生防和促生潜力，可作为开发五彩秋海棠炭疽病生防制剂的有前景的候选菌株。未来研究将利用高通量测序、转录组和代谢组分析进一步阐明其机制及在秋海棠属和其他草本植物中的应用潜力。