急性髓系白血病中全面的lincRNA转录组：整合儿童和成人队列中已知和新鉴定的lincRNAs

《Non-Coding RNA》：Comprehensive lincRNA Transcriptome in Acute Myeloid Leukemia: Integrating Known and Newly Identified lincRNAs Across Pediatric and Adult Cohorts

　　

背景/目的：急性髓系白血病（Acute Myeloid Leukemia, AML）包含具有不同基因表达谱的遗传亚类。虽然AML基因表达研究主要关注蛋白质编码基因，但研究人员对长基因间非编码RNA（long intergenic noncoding RNA, lincRNA）表达模式的理解仍不完整。这归因于有限的样本量，以及具有情境依赖性表达的lncRNA注释不完善。方法：为弥补这一空白，研究人员开发了生物信息学流程LIRA（long intergenic noncoding RNA annotator），使用严格标准（包括剪接和基因间转录本）以及排除编码潜能的算法来鉴定新型lincRNA。结果：将LIRA应用于来自878例儿童和成人AML病例以及20例健康对照的RNA测序数据，研究人员鉴定出1560个新型lincRNA，使GENCODE v38的lincRNA目录扩充了27%。整合内部生成的来自KMT2A::MLLT3样本的CAGE和ChIP测序数据显示，80%的新型lincRNA具有5′帽结构，至少67%在其转录起始位点携带激活型表观遗传标记。对1000个表达最可变的已知和新型lincRNA进行无监督分析，揭示了亚类特异性的表达模式，与蛋白质编码基因观察到的模式相似。加权基因共表达网络分析（Weighted Gene Co-expression Network Analysis, WGCNA）鉴定出17个与AML亚类相关的lincRNA表达模块。值得注意的是，在降解致白血病癌融合蛋白KMT2A::MLLT3和PML::RARA后，这些模块的表达下降，表明lincRNA表达对致癌信号具有响应性。结论：这项全面分析表明，lincRNA展现出与蛋白质编码基因相似的亚类特异性表达模式，为未来针对遗传定义的AML亚类的研究建立了宝贵资源，并对生物标志物发现和靶向治疗具有潜在意义。

**论文解读：《Non-Coding RNA》发表的急性髓系白血病lincRNA转录组综合研究**

**研究背景、问题与目的**
急性髓系白血病（Acute Myeloid Leukemia, AML）是一种遗传异质性疾病，其亚类由特定遗传异常（如染色体易位和基因突变）定义。既往研究已通过蛋白质编码基因的表达谱对AML进行分型，但对长基因间非编码RNA（long intergenic noncoding RNA, lincRNA）在AML中的表达模式认识不足。lincRNA虽在基因表达调控、代谢和信号转导中发挥关键作用，但因其组织特异性表达及注释不完整，尤其是在疾病背景下，大规模系统性鉴定尚属空白。现有lncRNA数据库多基于健康组织，缺乏对白血病特异性lincRNA的收录。为此，研究人员开发了生物信息学流程LIRA（Long Intergenic Noncoding RNA Annotator），旨在从大规模患者队列中识别新型lincRNA，并全面解析lincRNA转录组与遗传定义的AML亚类之间的关联，为生物标志物发现和靶向治疗提供资源。

**主要关键技术方法**
研究人员使用了来自四个独立队列的878例AML样本（包括儿童AML-05队列、TARGET队列、成人BEAT队列和TCGA-LAML队列）以及20例健康对照样本（其中19例为健康骨髓，1例为健康CD34⁺细胞）。采用STAR进行参考基因组比对，StringTie进行从头转录本组装。随后通过排除已知注释转录本（Ensembl、GENCODE、LNCipedia、RefSeq）、筛选剪接、基因间位置、长度>200核苷酸，并利用CPAT和PLEK算法评估编码潜能，最终鉴定出1560个新型lincRNA。此外，利用内部生成的KMT2A::MLLT3样本的CAGE-seq（Cap Analysis of Gene Expression）、ChIP-seq数据及BLUEPRINT联盟的表观遗传标记数据验证新型lincRNA的特征。使用Combat-seq进行批次校正，DESeq2进行标准化，UMAP进行降维聚类，WGCNA（加权基因共表达网络分析）构建共表达模块。针对KMT2A::MLLT3和PML::RARA癌融合蛋白的降解实验（PROTAC、DOT1L抑制剂、MENIN抑制剂及ATRA处理）采用公开RNA-seq数据集分析lincRNA表达变化。

**研究结果**

**2.1 长基因间非编码RNA注释器（LIRA）鉴定出1560个此前未注释的lincRNA**
通过对898个样本（878例AML、19例健康骨髓和1例健康CD34⁺）的RNA-seq数据进行LIRA流程分析，经严格过滤（排除与已知基因重叠、非剪接、长度<200 nt、具编码潜能的转录本），研究人员鉴定出1560个新型lincRNA（命名LIRA1–1560）。这些lincRNA分布于全基因组，在染色体13、14、15的短臂及Y染色体长臂基因贫乏区域存在缺失。与蛋白质编码转录本相比，新型lincRNA外显子更少、长度更短。

**2.2 新型lincRNA具有5′帽结构且转录起始位点含转录相关表观遗传标记**
在KMT2A::MLLT3 AML样本中，RNA-seq显示220个新型lincRNA表达。CAGE-seq分析表明80%与单向转录起始位点（Transcription Start Site, TSS）重叠，其中67%还至少与一种活性组蛋白标记（H3K4me3、H3K4me1、H3K27ac）重叠。IGV可视化展示了个别lincRNA的替代TSS、可变剪接及双链表达特征，证实新型lincRNA与已知lincRNA具有相似特征。

**2.3 lincRNA在遗传定义的AML亚类中展示出独特表达模式**
对878例AML和19例健康骨髓样本进行批次校正后，基于1000个最可变蛋白质编码转录本和1000个最可变新型lincRNA分别进行UMAP分析，结果显示遗传亚类（如CBFB::MYH11、PML::RARA、KMT2A::MLLT3、RUNX1::RUNX1T1、NPM1突变等）在两组数据中均形成明显聚类。整合已知（79%）和新型（21%）lincRNA后，基于1000个最可变lincRNA（其中35%为新型）的UMAP同样重现亚类特异性分组，表明lincRNA表达谱强烈反映AML遗传背景。

**2.4 lincRNA共表达模块与遗传定义的AML亚类相关**
对1000个最可变lincRNA进行WGCNA，鉴定出17个共表达模块（大小10–183个基因，新型lincRNA占比13–92%）及1个剩余模块。每个模块至少与三个遗传亚类或健康骨髓呈显著正相关（红色）或负相关（蓝色）。例如，模块8和10与KMT2A重排（KMT2A-R）强正相关，模块2和7与PML::RARA强正相关。模块中包含32个既往已报道参与正常及恶性造血的已知lincRNA（如CRNDE、PCAT18、LINC01257）。

**2.5 亚类特异性lincRNA表达在KMT2A::MLLT3和PML::RARA降解后减弱**
在KMT2A::MLLT3永生化脐血CD34⁺细胞中，PROTAC介导的癌融合蛋白降解导致模块8和10表达显著下降；DOT1L抑制剂（EPZ-5676）和MENIN抑制剂（VTP-50469）单用或联用同样降低这些模块表达，且联用效果更强。在PML::RARA阳性患者骨髓样本中，ATRA（全反式维甲酸）处理（20–24小时）导致模块2和7表达呈下降趋势，表明lincRNA模块表达受癌融合蛋白活性调控。

**2.6 儿童与成人AML之间lincRNA共表达模块的差异**
针对儿童和成人共享的遗传亚类（CEBPA突变、FLT3-ITD、CBFB::MYH11、RUNX1::RUNX1T1、KMT2A重排）进行WGCNA，鉴定出20个模块。约50%的模块—亚类相关性在儿童和成人中一致，但部分模块在同亚类的儿童与成人间存在显著表达差异，提示亚类驱动的lincRNA表达模式总体保守，但表达水平可能因年龄而异。

**讨论与结论总结**
讨论部分指出，此前研究多关注健康组织中的lincRNA，本研究通过LIRA在898个样本中鉴定1560个新型lincRNA，使已知lincRNA数量增加27%。这些新型lincRNA部分反映了AML相关转录失调，部分为低表达或特定细胞类型/发育阶段未注释的普遍表达转录本。GENCODE v47中已出现590个与本研究相同的新型lincRNA，验证了LIRA的可靠性。由于LIRA刻意聚焦于剪接的基因间lincRNA，因此排除了基因重叠（正义或反义）及内含子lncRNA（如ANRIL、RUNXOR、IRAIN、HOTAIRM1），但长读长RNA-seq未来可能更可靠地鉴定这类转录本。基于大样本量，研究呈现了迄今最全面的AML lincRNA表达谱，无监督UMAP分析显示lincRNA与蛋白质编码基因类似，均能根据遗传亚类紧密聚类。WGCNA鉴定的17个模块（共含755个lincRNA）与各亚类相关，其中32个lincRNA已有白血病关联报道（如CRNDE在PML::RARA中过表达，PCAT18在NPM1突变中加速细胞周期，LINC01257在RUNX1::RUNX1T1儿童AML中为潜在治疗靶点）。癌融合蛋白降解实验表明高模块表达是KMT2A::MLLT3和PML::RARA的下游效应。未来需确定单个lincRNA是否直接受癌融合蛋白激活，并进一步研究其在AML中的功能及作为生物标志物和治疗靶点的潜力。

**研究结论翻译**：本研究提出了LIRA（长基因间非编码RNA注释器），一个免费可用的用于鉴定新型lincRNA的流程。利用LIRA，研究人员将AML中已注释的lincRNA谱系扩充了27%。对898例AML和健康样本的全面分析揭示，与蛋白质编码基因类似，lincRNA表达模式紧密反映已建立的遗传AML亚类。加权基因共表达网络分析发现了与这些亚类相关的模块。总之，该工作为功能研究提供了资源，促进了对lincRNA作为生物标志物和治疗靶点的探索，最终目标是改善AML患者的预后。