采用非破坏性方法，通过PCR从实验血痕和博物馆标本中测定ABO血型和Amelogenin

《Genes》：ABO and Amelogenin Determination by PCR, from Experimental Bloodstains and from Museum Specimens, Using a Non-Destructive Approach

　　

摘要翻译：背景/目的：博物馆藏品构成研究广泛组织学过程的宝贵材料，这源于博物馆策展人对罕见和晚期疾病病例的历史选择，这些病例由于医学进步在当代临床实践中很少遇到。古代DNA在系统发育研究以及群体遗传学分析中起着关键作用。然而，许多常用的DNA提取技术在DNA分离前涉及样本的部分降解。使用非破坏性方法可能使研究人员能够回收适用于后续分析的DNA。用于研究目的的非破坏性DNA提取方法是近期的发展，并促进了博物馆藏品的遗传分析。ABO和Amelogenin是所提出方法的应用示例，尽管任何引物组都可使用。ABO基因分型已广泛用于系统发育和群体分析。方法：本研究提出一种基于PCR的非破坏性方法，用于从保存的博物馆样本中提取DNA。研究人员分析了人体组织样本、保存过程中使用的过滤材料以及处理后的保存液（经稀释和透析），以确定ABO基因型和性别（基于Amelogenin）。结果：在所有三种样本类型（组织、滤纸和保存液）中观察到相同的可重复PCR图谱（ABO血型和由Amelogenin确定的性别）。使用保存液是一个新进展，因为它使样本保持完整。然而，这种方法有一个缺点：DNA非常缓慢地扩散到保存液中，需要几十年才能达到足够的浓度。该方法的一个主要优势是不需DNA制备即可进行PCR测试。结论：博物馆来源的样本代表可靠的DNA来源，可有效用于基于PCR的分析。所提出的方法适用于降解DNA样本，将已建立的极短Amelogenin扩增子与用于ABO基因分型的PCR序列特异性引物相结合。

**论文解读文章**

**研究背景**
博物馆藏品因其对罕见疾病病例的历史性收集，成为研究组织学过程及人类历史的重要资源。古代DNA（aDNA）在系统发育和群体遗传学分析中具有关键作用。然而，传统DNA提取方法常需破坏样本，这不利于处理珍贵的博物馆材料。非破坏性方法的发展使研究人员能从保存样本中回收可扩增DNA，避免样本损伤。ABO血型系统由Karl Landsteiner于20世纪初发现，其基因分型在法医学、群体遗传学和移植医学中广泛应用。Amelogenin基因则用于性别鉴定。尽管这些标记在法医学中已成熟，但针对百年以上博物馆样本（保存于乙醇-甘油混合液中）的非破坏性DNA来源及优化多重PCR设计仍属空白。此前研究依赖表面拭子或组织浸泡法，本研究首次证明原始保存液（经数十年储存）及过滤滤纸可作为可靠且可扩增的DNA来源，而无需损伤原始标本。论文发表在《Genes》期刊。

**研究开展与结论**
研究人员从弗罗茨瓦夫医科大学法医学博物馆获取了20个超过150年历史的人体组织样本，同时收集了12份现代血痕样本（来自波兰白种人志愿者，ABO血型经血清学方法预知）。通过非破坏性策略，从三种来源（组织、保存液过滤用的Whatman GF/C滤纸、稀释并透析后的保存液）提取DNA，并建立多重PCR体系同时检测ABO基因型和Amelogenin性别决定位点。结果表明：所有样本类型均获得一致且可重复的ABO和Amelogenin图谱；PCR扩增成功率达88.3%（组织95.0%、保存液86.7%、滤纸83.3%）；检测灵敏度下限为0.5 ng/μL输入DNA；现代血痕样本的基因型与血清学结果100%一致；博物馆标本中，20个样本均获得完整分型，且同一标本的三类来源（组织、滤纸、保存液）产生完全相同的ABO和Amelogenin图谱。研究意义在于：提供了一种低成本、快速、非破坏性的初步筛选工具，可评估博物馆样本的DNA可保存性，为后续高成本分析（如miniSTR、SNP或大规模并行测序）保留完整标本。

**主要关键技术方法**
1. **样本来源**：博物馆标本来自弗罗茨瓦夫医科大学法医学博物馆（>150年），保存于30%乙醇、10%甘油混合液（不含甲醛）；现代血痕来自12名波兰白种人志愿者。
2. **DNA提取**：
- 组织和滤纸：使用NucleoSpin^? Tissue Column（Macherey-Nagel）柱离心法，组织25 mg或滤纸约1 cm²，经蛋白酶K（Proteinase K）消化后按说明书操作，最终洗脱于50 μL Buffer BE。
- 保存液：取50 μL过滤后的保存液，在Visking透析膜（孔径12–14 kDa截留）中先后于PCR缓冲液（100 mM Tris、500 mM KCl、0.1% Tween 20、2 mM MgCl₂，pH 8.35）和去离子水中各透析12 h，以去除乙醇、甘油等抑制剂。
3. **多重PCR扩增**：引物根据Jiang等（2011）设计，ABO扩增子50–100 bp（0等位基因78/92 bp、A等位基因82/92 bp、B等位基因82/97 bp），Amelogenin扩增子208/214 bp；使用Qiagen^? Multiplex PCR Master Mix，反应体积10 μL（含4 μL DNA模板），热循环条件：95°C 15 min；30个循环（94°C 30 s、63°C 60 s、72°C 45 s）；72°C 10 min。
4. **毛细管电泳**：产物在ABI Prism 3130 Genetic Analyzer上分离（POP-4聚合物，36 cm毛细管），以ROX500内标（50–500 bp）进行片段分析。
5. **污染控制**：遵循古代DNA指南（包括独立实验室空间、紫外线灭菌、提取空白和PCR阴性对照、每次实验至少两个独立重复）。

**研究结果**

**3.1 博物馆标本DNA提取**：采用柱离心法从组织和滤纸中提取DNA，保存液经4°C透析处理。20个博物馆标本中，组织DNA浓度20±2.5 ng/μL，保存液10±3.1 ng/μL，滤纸5–10 ng/μL。

**3.1.1 灵敏度与可重复性**：将已知A型男性血痕DNA从10 ng/μL连续稀释至0.1 ng/μL，在0.5 ng/μL输入量下仍获完整ABO和Amelogenin图谱（RFU>150）；0.2 ng/μL时6次重复中2次出现等位基因丢失（33%），故灵敏度限设为0.5 ng/μL。所有12份现代血痕的重复PCR与血清学结果100%一致；20个博物馆标本在三种来源间的三重复分析也100%一致，提取空白和PCR阴性对照均阴性。

**3.1.2 扩增成功率**：20个标本×3来源×3次重复共180次PCR反应，总体成功率88.3%（159/180），其中组织95.0%（57/60）、保存液86.7%（52/60）、滤纸83.3%（50/60）。等位基因丢失出现于3.9%的反应（7/180），全部发生在DNA浓度低于0.3 ng/μL时。

**3.2 血痕分析**：12个血痕样本中，ABO和Amelogenin位点均稳定检出，基因型与本地输血科的血清学分型完全一致。ABO产物大小（78、82、92、97 bp）分别为：0型78+92 bp、A型82+92 bp（纯合AA）或78+82+92 bp（杂合A0）、B型82+97 bp（纯合BB）或78+82+92+97 bp（杂合B0）、AB型82+92+97 bp。Amelogenin男性样本出现209+215 bp（X+Y），女性样本仅209 bp（X）。

**3.3 博物馆标本分析**：在全部20个博物馆标本中（包括组织、滤纸和透析保存液），ABO和Amelogenin均获得可重复的完整分型图谱。来自同一标本的三种不同材料（组织、滤纸、保存液）产生完全一致的ABO和Amelogenin分型结果（如III-33标本为A0型女性），证实非破坏性DNA回收的可靠性。短扩增子长度（ABO 50–100 bp，Amelogenin 208 bp）确保了即使高度降解DNA也能成功扩增。

**讨论与结论**
**总结讨论**：博物馆样本因保存条件差异导致DNA降解和PCR抑制剂（乙醇、甘油）存在，本研究采用的三种纯化方法（柱离心、Chelex加热、透析）均成功去除抑制剂。短扩增子（<150 bp）是应对片段化的关键。与现有方法相比，该多重PCR成本低、操作简便，可优先用于筛选样本DNA可保存性，再决定是否进行高成本深度分析（如miniSTR、SNP分型、大规模并行测序）。ABO系统自身鉴别力有限，但可结合历史血清学数据或与其他标记联用。研究局限包括：仅测试乙醇-甘油保存液，甲醛固定样本可能失败；透析耗时24小时；样本量较小。未来可扩大样本类型并优化快速抑制剂去除方法。

**翻译研究结论**：本研究成功开发并验证了一种基于PCR的非破坏性方法，用于从乙醇-甘油混合液中保存超过100年的博物馆标本进行ABO血型分型和性别鉴定（Amelogenin）。主要结论如下：
- **非破坏性DNA来源**：原始保存液和关联滤纸含有可扩增DNA，允许完整保留原始标本。
- **三类来源交叉验证**：同一标本的组织、滤纸和透析保存液产生完全相同的ABO和Amelogenin图谱，证实方法可靠性。
- **方法稳健性**：超短扩增子（ABO 50–100 bp，Amelogenin 208 bp）使即使高度降解DNA也能实现可重复PCR扩增；严格的污染控制（遵循古代DNA指南）和预设判读标准支持结果真实性。
- **博物馆基因组筛选工具**：低成本、快速的多重PCR可作为一线筛查测试，在将珍贵标本投入昂贵高通量分析（miniSTR、SNP或大规模并行测序）前评估DNA可保存性。
- **广泛适用性**：相同的非破坏性策略可适应其他遗传标记（如线粒体DNA、微单倍型），只需重新设计引物并保持扩增子短小（<150 bp）。