双读数RPA-PfAgo系统用于快速检测牛乳中无乳链球菌的开发与应用

《Veterinary Sciences》：Development and Application of a Dual-Readout RPA-PfAgo System for Rapid Detection of Streptococcus agalactiae in Bovine Milk

　　

无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）是牛乳腺炎的主要传染性病原体，在乳制品行业造成重大经济损失。在本研究中，研究人员建立并优化了一种靶向无乳链球菌保守cfb基因的双读数RPA-PfAgo检测平台。设计并筛选了七对RPA引物以构建基础RPA（Basic-RPA）检测，同时评估了六种引导DNA（gDNA）及一种特异性探针用于PfAgo辅助检测。使用从中国五个奶牛养殖区采集的153份牛乳样本进行现场验证，并将检测性能与细菌学培养和标准化定量PCR（qPCR）检测进行比较。基础RPA（Basic-RPA）检测在37 °C下30分钟达到最佳扩增，检测限为1 × 10^?3 ng/μL，且与非靶标细菌无交叉反应。优化的RPA-PfAgo-RTF检测可检测低至10 copies/μL，而RPA-PfAgo-LFD检测可检测100 copies/μL，两种形式均显示出高分析特异性。在现场牛乳样本中，细菌学培养检测出21份阳性样本，而标准化实时PCR（qPCR）、RPA-PfAgo-RTF和RPA-PfAgo-LFD各检测出33份阳性样本。与作为传统比较基准的细菌学培养相比，所有三种分子检测均显示出100.00%的阳性符合率、90.91%的阴性符合率及Kappa值为0.733。此外，在所有153份样本中，RPA-PfAgo-RTF和RPA-PfAgo-LFD与标准化qPCR检测完全一致。这些结果表明，双读数RPA-PfAgo平台是检测牛乳中无乳链球菌的一种快速且可靠的分子工具。

**研究背景、存在问题及研究目的**
无乳链球菌（Streptococcus agalactiae，又称B群链球菌，GBS）是牛乳腺炎的主要传染性病原体，可在牛群中引起30%至70%的乳腺炎病例，造成乳产量下降、乳制品质量受损及显著的经济损失。该病原体还可通过乳制品传播，对公共卫生构成风险。常规的细菌学培养方法耗时长（通常需数天）、劳动强度大，且可能漏检低水平感染或亚临床病例，导致病原体在牛群中隐匿传播。现有分子检测方法如定量PCR（qPCR）虽灵敏度高，但依赖昂贵的热循环仪器和专业操作，不适用于资源有限地区的现场快速筛查。为此，研究人员旨在开发一种结合重组酶聚合酶扩增（RPA）与火球菌Argonaute（PfAgo）蛋白的双读数检测平台，提供实时荧光（RPA-PfAgo-RTF）和侧流层析试纸条（RPA-PfAgo-LFD）两种输出形式，以实现对牛乳中无乳链球菌的快速、高灵敏、高特异性检测。该研究论文发表在《Veterinary Sciences》。

**研究内容及意义**
研究人员以无乳链球菌保守的cfb基因为靶标，设计并筛选了RPA引物和PfAgo引导DNA（gDNA），优化了Basic-RPA及RPA-PfAgo反应条件（温度、时间、Mn²⁺浓度、gDNA浓度、分子信标浓度），建立了RPA-PfAgo-RTF（荧光读数）和RPA-PfAgo-LFD（侧流试纸条读数）两种检测方法。通过153份来自中国五个奶牛养殖区（河南、辽宁、黑龙江、山东、河北）的牛乳样本（含临床乳腺炎67份、亚临床乳腺炎61份、健康乳25份）进行现场验证，并与细菌学培养和标准化qPCR进行比较。该平台实现了快速（RPA 30分钟 + PfAgo 50分钟）、高灵敏度（荧光法10 copies/μL，试纸条法100 copies/μL）、高特异性（无交叉反应），且与qPCR完全一致，阳性检出率高于培养法，为牛乳中无乳链球菌的现场筛查和实验室确认提供了灵活实用的分子工具。

**关键技术方法概述**（不超过250字）
研究人员从五个中国奶牛养殖区（河南、辽宁、黑龙江、山东、河北）采集153份牛乳样本（含临床乳腺炎、亚临床乳腺炎及健康乳分类）。关键技术方法包括：（1）以无乳链球菌cfb基因为靶标，使用Primer 5.0设计七对RPA引物，经琼脂糖凝胶电泳筛选最佳引物对Cfb166F/Cfb166R，并优化Basic-RPA反应温度（37 °C）和时间（30 min）；（2）基于cfb序列设计六种gDNA，经20% TBE-PAGE筛选最佳gDNA（Zg5），并据此设计额外gDNA及分子信标（MB）；（3）建立RPA-PfAgo-RTF反应体系，优化MnCl₂浓度（2.4 mM）、gDNA浓度（1.5 μM）、MB浓度（9 μM）、反应温度（95 °C）和时间（50 min），设定荧光阈值100,000 AU区分阴阳性；（4）建立RPA-PfAgo-LFD体系，使用生物素标记的LFD-MB，通过试纸条T线和C线显色判断结果；（5）以细菌学培养（NY/T 2962—2016）和标准化qPCR（SN/T 5887—2025）为参考方法，通过灵敏度、特异性、现场样本一致性评估平台性能。

**研究结果**（保留原文小标题，简要说明通过什么研究得出什么结论）

**3.1. RPA引物的设计与筛选**
通过七对引物对pGEM-T-cfb质粒的扩增和琼脂糖凝胶电泳分析，引物对Cfb166F/Cfb166R产生清晰靶标条带且阴性对照无扩增，被选为最佳引物对用于后续实验。

**3.2. 基础RPA（Basic-RPA）检测的建立与优化**
优化温度和时间后，在37 °C反应30 min获得最佳扩增效率。特异性检测显示，仅无乳链球菌阳性对照产生扩增条带，十种非靶标细菌（如单核细胞增生李斯特菌、副猪格拉瑟菌、多杀性巴氏杆菌等）及无模板对照均无交叉反应。灵敏度测试表明，Basic-RPA可检测低至1 × 10^?3 ng/μL的质粒DNA。

**3.3. PfAgo切割活性验证及候选gDNA筛选**
通过20% TBE-PAGE电泳，证实PfAgo具有单链DNA（ssDNA）切割活性，并筛选出切割效率最高的gDNA（Zg5），基于Zg5设计出额外gDNA及分子信标用于后续检测。

**3.4. RPA-PfAgo-RTF检测的建立与优化**
优化后的反应条件为95 °C反应50 min、2.4 mM Mn²⁺、1.5 μM gDNA、9 μM MB探针，荧光阈值设为100,000 AU。特异性测试显示，无乳链球菌阳性对照荧光信号超过400,000 AU，非靶标细菌信号均低于阈值。灵敏度测试表明，该法可检测低至10 copies/μL的质粒DNA。

**3.5. RPA-PfAgo-LFD检测的分析特异性和分析灵敏度**
特异性测试中，仅无乳链球菌阳性样本在试纸条上同时出现C线和T线，非靶标细菌仅出现C线，无交叉反应。灵敏度测试显示，该法可检测低至100 copies/μL的质粒DNA，灵敏度低于荧光法。

**3.6. 使用牛乳样本对qPCR、RPA-PfAgo-RTF和RPA-PfAgo-LFD进行多区域现场验证**
在153份牛乳样本中，RPA-PfAgo-RTF和RPA-PfAgo-LFD与标准化qPCR结果完全一致（均检出33份阳性）。以细菌学培养为传统比较基准，三种分子检测的阳性符合率为100.00%，阴性符合率为90.91%，Kappa值为0.733。培养法仅检出21份阳性（临床乳腺炎10份、亚临床11份），而分子法检出33份阳性（临床15份、亚临床18份）。所有25份健康乳样本均为阴性。

**讨论总结与结论翻译**
讨论部分指出，基于cfb基因的RPA-PfAgo平台通过筛选高效引物和gDNA、优化反应条件，实现了高特异性（无交叉反应）和高灵敏度（荧光法10 copies/μL，试纸条法100 copies/μL），现场验证与qPCR完全一致，阳性检出率高于培养法。荧光法更适用于实验室检测（需荧光仪器），而侧流试纸条法适合现场筛查（需核酸提取和加热设备）。该平台并非完全免设备，但简化了结果判读。局限性包括：现场验证样本量中等（仅33份qPCR阳性）、未通过测序或复合参考框架解决培养-分子差异结果、未评估反应条件间的交互效应等。
结论翻译：综上，双读数RPA-PfAgo平台表现出高分析特异性和灵敏度，与标准化qPCR完全一致，且现场牛乳样本的阳性检出率高于细菌学培养。荧光形式更适合实验室检测或确证分析，而LFD形式提供简化的可视化判读，在有核酸提取和紧凑式加热设备时可支持现场筛查。这些发现共同支持RPA-PfAgo-RTF和RPA-PfAgo-LFD作为检测牛乳中无乳链球菌的高效分子工具的潜力。