《Applied Microbiology》：Bacillus thuringiensis subsp. israelensis at the Public Health–Ecology–Biotechnology Nexus: From Larvicidal Precision to Protein Delivery Platform Potentials
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本文综述了苏云金芽孢杆菌以色列亚种（Bacillus thuringiensis subsp. israelensis, Bti）作为一种高选择性的微生物杀幼虫剂以及基于其原核昆虫杀幼虫细胞器（Prokaryotic Insect Larvicidal Org
本文综述了苏云金芽孢杆菌以色列亚种（Bacillus thuringiensis subsp. israelensis, Bti）作为一种高选择性的微生物杀幼虫剂以及基于其原核昆虫杀幼虫细胞器（Prokaryotic Insect Larvicidal Organelle, PILO）结构特征的蛋白质储存与递送生物学平台的应用。Bti仍是目前全球部署最广泛的蚊虫控制生物制剂。数十年的实地应用表明，其在综合媒介管理项目（Integrated Vector Management Programs, IVMP）中具有显著的公共卫生效益，且仅产生有限、可控的生态权衡。其狭窄的宿主范围确保了对人类及其他脊椎动物的良好安全性记录。此外，实验室与实地研究一致表明，非靶标效应极小，具有情境依赖性、可逆性，且主要局限于近缘的非靶标水生双翅目昆虫。这些特性使Bti成为全球环境可持续型IVMP的基石。研究人员在此综合了关于Bti生物学、生态选择性、野外表现以及嵌入PILO分子结构中的抗性管理特性的现有知识。最后，研究人员评估了将PILO重新用作体内微生物工厂以包装异源蛋白质的新兴机遇与技术限制，该应用具有潜在的药用和工业用途。
1 引言
虫媒传染病由病毒性和寄生虫性病原体引起，仍是全球重大公共卫生威胁，使全球超过半数人口（~4,000,000,000）处于风险之中，占全球传染病负担的相当大比例。蚊类是最重要的流行学意义群体，因其近全球性分布及传播异常广泛的病毒、原虫和蠕虫的能力。气候驱动的温度、降水和栖息地适宜性变化可增强蚊虫存活、加速病原体发育并延长传播季节，促进纬度和海拔范围的扩展。同时，快速城市化、人类流动以及埃及伊蚊（Aedes aegypti）、白纹伊蚊（Ae. albopictus）、韩国伊蚊（Ae. koreicus）、日本伊蚊（Ae. japonicus）、致倦库蚊（Culex quinquefasciatus）和斯氏按蚊（Anopheles stephensi）等入侵性媒介的扩散持续破坏历史上可预测的疾病传播模式。盘尾丝虫病（由Onchocerca volvulus引起，通过黑蝇Simulium species传播）仍主要集中于非洲和也门。化学杀虫剂抗性的发展以及针对许多蚊媒传染病缺乏广泛有效疫苗的事实，凸显了持久、环境可持续的媒介控制策略的重要性。在此背景下，Bti保持着作为全球部署最广泛、生态上最可接受的蚊虫控制微生物杀幼虫剂的地位。Bti在早期盘尾丝虫病计划中对幼虫Simulium species的大规模控制也发挥了历史性重要作用。自1970年代末发现以来，Bti经实验室和现场评估，发现对人类、野生动物或大多数其他非靶标生物风险极低，由此获得美国环境保护署（U.S. Environmental Protection Agency, EPA）等机构的监管批准及世界卫生组织（World Health Organization, WHO）的认可。Bti的杀幼虫活性由芽孢形成期间产生的Cry（晶体）和Cyt（细胞溶解）蛋白毒素组合介导。Cry毒素作为孔形成δ-内毒素，与蚊幼虫中肠特定受体结合；Cyt毒素则通过插入膜中并增强Cry活性而协同作用。
2 Bti的一般生物学
Bti是芽孢杆菌属（Bacillus cereus）广义种群中的革兰氏阳性、需氧、产芽孢细菌。与其他苏云金芽孢杆菌（Bt）亚种类似，其具有双相生命周期，即在营养受限条件下由营养生长转为芽孢形成。在芽孢形成过程中，细菌产生内生芽孢和副芽孢体，后者最近被表征为原核昆虫杀幼虫细胞器（PILO），其超微结构特征已有详细描述。这些特征的大部分遗传决定因素编码于大型产毒质粒pBtoxis上。PILO由蛋白前毒素组成，这些前毒素以极高水平表达并在芽孢形成期间组装成晶体包含体。这些包含体由两种Cry晶体（Cry4Aa1 + Cry4Ba1和Cry11Aa1）以及一种Cyt晶体（Cyt1Aa1）组成，各自独立合成并包裹于多孔的多层纤维状基质（Multilamellar Fibrous Matrix, MFM）中。在成熟末期，这些包含体被MFM共包埋形成复合PILO。PILO和内生芽孢各约1 μm大小，为独立的细胞质实体，于细菌自溶时释放。PILO在易感蚊幼虫摄食前保持生物学惰性，摄食后触发中肠上皮的破坏性溶解。
近期研究揭示了Bti毒力的额外结构和功能层面。具体而言，内生芽孢和PILO均被包裹于此前未被识别的"芽孢丝"（sporesilk）基质中，该基质由宽约8 nm、具有双螺旋对称性的纤维组成。这些纤维由堆叠的α-螺旋发夹亚基（称为α-芽孢附属物，A-ENA）的原丝形成。值得注意的是，A-ENA纤维通过广泛的分子间共价交联稳定，每个亚基有多达十个自催化、邻近诱导的异肽键，形成具有 exceptional 化学和物理稳健性的连续共价聚合物。功能上，芽孢丝基质作为毒力因子，介导内生芽孢和PILO聚集成多组分感染性簇。这种聚集增强了杀虫功效，可能通过促进芽孢和毒素包含体在幼虫肠道中的共递送和滞留实现。重要的是，重组A-ENA纤维可在体外自组装，且将这些纳米纤维添加至缺乏天然芽孢丝的本缺Bti菌株可恢复芽孢-PILO聚集并相应获得毒力增益。这些发现不仅重塑了对Bti感染性颗粒结构组织的理解，也为理性、非基因改造的功能化生物害虫控制制剂提供了策略。
3 Bti的Cry和Cyt毒素结构特征与毒性
Bti Cry和Cyt毒素的结构和生化特性已被广泛表征。在其活化形式中，大多数Cry毒素采用保守的三结构域折叠，该折叠是受体特异性和膜破坏的基础。结构域I由α-螺旋束组成，在寡聚化和膜插入过程中发生显著的构象重排，最终导致孔形成。结构域II富含β-折叠，呈现介导受体识别和宿主特异性的可变表面环，而结构域III则有助于受体相互作用、寡聚体稳定和整体结构完整性。
这些结构特征构成了Cry毒性经典孔形成模型的基础。易感幼虫摄食后，Cry前毒素在碱性中肠中溶解并经蛋白水解活化。活化毒素随后顺序结合中肠上皮受体，包括钙黏蛋白（cadherins）、氨肽酶N（aminopeptidase N）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）、α-淀粉酶（α-amylase）和ABC转运蛋白（ABC transporters），主要通过结构域II和III介导。受体结合促进毒素寡聚化并触发结构域I的构象变化，使其能够膜插入和孔形成。 resulting 孔破坏离子稳态和渗透平衡，导致上皮细胞肿胀、溶解、中肠屏障破坏及幼虫死亡。该框架的扩展提出，与钙黏蛋白的初始结合诱导N端α1螺旋的切割或位移，生成膜 competent 的前孔，随后与次级受体结合促进插入。
最近的遗传和功能研究扩展了这一模型，鉴定ABC转运蛋白为许多Cry毒素的必需功能受体。在此框架中，Cry-ABC转运蛋白相互作用不仅仅是允许结合，而是直接参与毒性，可能介导膜插入或不稳定化。靶标昆虫中的抗性等位基因频繁定位于ABC转运蛋白基因，即使与钙黏蛋白或GPI锚定受体的结合得以保留，也能消除毒性，突显了这些转运蛋白在Cry诱导毒性中的核心作用。同时，另一种基于信号的替代模型提出，Cry毒素结合激活细胞内信号通路，包括Mg
2+依赖性G蛋白信号和细胞骨架重塑，这些通路促进细胞死亡，孔形成以协同或情境依赖的方式发挥作用，而非唯一的致死事件。
Cyt毒素在结构和作用机制上与Cry毒素有根本区别。它们是较小的蛋白质，属于β-孔形成毒素超家族而非三结构域Cry家族。活化Cyt毒素的晶体结构揭示紧凑的α/β结构，具有暴露的疏水区域，促进直接插入脂质双层，产生广泛的膜破坏性活性和有限的受体特异性。在Bti中，Cry和Cyt毒素协同作用，即Cyt蛋白可作为膜锚或替代受体，促进Cry寡聚化和膜插入，即使在缺乏经典蛋白受体的情况下也是如此。这种协同机制增强杀幼虫效力并抑制抗性的出现，被认为是Bti制剂的决定性特征。
Cyt1Aa1的重要性在PILO被蚊幼虫摄食后进一步凸显，此时Bti晶体在高度碱性的幼虫中肠中溶解并经蛋白水解活化。虽然Cyt1Aa1单独显示的杀幼虫活性相对较低，但它表现为高度亲脂性毒素，直接与膜脂质结合而非依赖确定的蛋白受体。为防止在Bti合成期间及异源细菌宿主中的过早膜损伤，Cyt1Aa1需要辅助伴侣蛋白P20（编码于pBtoxis上的cry11Aa1操纵子内）以促进适当的晶体化和在细菌细胞内的毒素稳定。Cyt1Aa1的生物学意义在于其与Cry4Aa1、Cry4Ba1和Cry11Aa1针对蚊和黑蝇幼虫的强协同相互作用，以及其抑制或延缓抗性进化的能力，使其成为复合Bti PILO不可或缺的组分。
重要的是，Cyt1Aa1的协同能力超出了天然Bti Cry毒素的范围。Cyt1Aa1可恢复或增强球形赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus sphaericus）双毒素Tpp1Aa1/Tpp2Aa1（原称BinA/BinB）对固有抗性种群或抗性蚊种的活性，包括埃及伊蚊和抗性致倦库蚊。早期模型提出Cyt1Aa1主要通过类似去垢剂的膜破坏或形成小的非特异性孔发挥作用。然而，最近的结构和机制研究支持涉及膜结合组装和情境依赖插入行为的更复杂过程。除其固有的膜活性外，Cyt1Aa1还可物理结合异源毒素，作为替代膜锚促进缺乏经典Cry受体的幼虫中Cry毒素的插入。这种协同的、受体非依赖性机制增强杀幼虫功效，并构成了区分Bti制剂的抗性缓解特性。
4 生态选择性与分类敏感性
4.1 靶向杀幼虫谱与生物学选择性
广泛的实验室、中型实验生态系统、野外和注册后研究一致表明，Bti在提供强杀幼虫活性的同时，保持狭窄的非靶标影响谱和对人类及其他脊椎动物的 exceptional 安全性。虽然高度选择性，Bti并非生态惰性；其可测量效应集中于有限的水生双翅目昆虫群，且往往是暂时的、栖息地依赖的、在适当管理下可逆的。这种选择性反映了Bti的杀幼虫谱主要局限于内翅亚目（Nematocera）中的蚊总科（Culicomorpha），包括蚊科（Culicidae）、蚋科（Simuliidae）、摇蚊科（Chironomidae）、蠓科（Ceratopogonidae）、幽蚊科（Chaoboridae）和几个较小的蚊科家族。
伊蚊属（如埃及伊蚊、白纹伊蚊）、按蚊属（如冈比亚按蚊复合种，An. gambiae s.l.）和库蚊属（如致倦库蚊、尖音库蚊复合种）的蚊幼虫高度易感，尽管敏感性因分类群而异。库蚊和按蚊通常需要比伊蚊更低的致死浓度，反映了幼虫取食行为和中肠受体可用性的差异。黑蝇幼虫，包括Simulium vittatum和S. pertinax，同样易感；然而，流水中的功效受水文条件、有机物含量和藻类对幼虫滤食和觅食干扰的强烈影响。其他蚊总科家族表现出更有限和可变的反应性：幽蚊科显示中等易感性和更高浓度下的易感性；蠓科显示不一致的敏感性；而细蚊科（Dixidae）、蛙股蚊科（Corethrellidae）和垂毛蚊科（Thaumaleidae）在环境相关剂量下通常不敏感。系统综述确认Bti主要影响靶标蚊总科分类群，最一致的
非靶标响应发生于摇蚊科物种。
虽然Bti的主要杀幼虫谱因此受到严格限制，但在操作环境之外进行的研究表明其生物活性并非绝对限于蚊总科。
4.2 操作生态学与栖息地依赖的表现
在野外条件下，Bti的生态足迹不仅取决于生物易感性，还取决于数十年媒介控制实践中完善的监测驱动部署策略。由于Bti仅针对主动取食的幼虫，其功效取决于准确的治疗前监测以确认幼虫存在、密度和发育阶段，确保应用的精准靶向和适时性。这种操作逻辑是主要盘尾丝虫病控制计划的核心，其中治疗与幼虫物候和水文条件同步，而非在整个河流系统中均匀或任意应用。
环境异质性强烈影响幼虫暴露和野外表现。水流、有机物含量、深度和连通性的差异影响毒素的分散和摄食。在Simulium spp.栖息的快速流动河流中，Bti可被快速稀释或携带下游，需要精心安排的应用时机，在某些情况下需要重复给药以维持有效暴露。这些原则支撑着主要控制计划，如盘尾丝虫病控制计划（Onchocerciasis Control Programme, OCP）、非洲盘尾丝虫病控制计划（African Programme for Onchocerciasis Control, APOC）和相关拉丁美洲工作，其中给药策略适应当地水文条件而非统一应用。
Bti的Cry和Cyt毒素的快速环境降解进一步增强了生态安全性，限制了持久性，同时需要治疗后监测和新幼虫群体出现时的重新应用。长期表现通过常规幼虫生物测定、微生物轮换和栖息地特异性给药策略得以维持。罗讷-阿尔卑斯蚊虫控制计划和OCP等成熟计划表明，当与生态监测相结合时，Bti维持持久效力，无操作抗性发展的证据。这一结论得到Becker的强化，他发现尽管在德国莱茵河谷进行了数十年的密集Bti应用，但野外刺扰伊蚊（Aedes vexans）种群中无抗性证据。这些研究将这种持续易感性归因于多种具有不同结合模式的Cry和Cyt毒素的协同作用，这些作用共同限制了抗性可用的进化路径。
虽然可在人工实验室选择下诱导抗性，但这些条件不能反映野外暴露情景。随着气候变化、城市化和入侵性蚊种改变生态背景，持续监测仍然审慎，但目前证据支持基于Bti的控制的长期可持续性。
4.3 非靶标边界与生态可逆性
在野外相关条件下，Bti表现出明确界定的非靶标效应，反映了其高选择性和长期安全使用历史。大多数水生无脊椎动物，包括枝角类、桡足类、蜉蝣目、毛翅目和水生甲虫，在操作剂量下显示很少或无敏感性，表明对非双翅目分类群的最小影响。相比之下，摇蚊科摇蚊是受影响的主要非靶标群体，因其与蚊的密切关系和相似的中肠生理学而对Bti毒素易感。
摇蚊中观察到的响应强烈依赖当地条件，物种组成、栖息地类型和应用频率的可预测差异。在反复处理的小型或孤立湿地中，报道了幼虫丰度的暂时下降；然而，这些变化始终是短暂的。种群恢复通常通过再定殖和快速世代周转在数周内发生，特别是在水文连通系统中，扩散过程保持完整。重要的是，这些效应主要局限于双翅目分类群，不会向更广泛的水生群落传播，突显了Bti应用的有限生态足迹。亚致死效应，如多代暴露下的发育延迟和较小的成虫体型，可在多代暴露下发生，但这些都是可逆的，主要受栖息地结构和连通性影响，而非指示持久或累积的生态危害。
摇蚊在营养循环、沉积物混合和跨食物网能量传递中发挥作用，因此短期减少可短暂影响小型、连通不良系统中的这些过程。然而，这种影响有限且短暂，在较大或连通良好的湿地中，快速再定殖和生态系统恢复力确保最小和短暂的生态影响。总体而言，这些暂时变化在典型野外条件下不会转化为有意义或持久的生态系统破坏。然而，摇蚊构成了可预测和可管理的非靶标群体，体现了Bti施加的轻微威胁，即与Bti应用相关的生态效应保持局部化、暂时性，并在监测数据指导、适当生态系统背景下应用时完全可逆。
4.4 高剂量或实验条件下的扩展生物活性
Bti更广泛的无脊椎动物易感性证据主要来自不能反映媒介控制计划中暴露条件的实验室或升剂量研究。在受控或异常高浓度下，Bti已被证明影响非蚊科双翅目如果蝇和真菌蚊，以及系统发育较远的昆虫群，包括豌豆和马铃薯蚜虫，以及某些鞘翅目如棉铃象甲和叶甲。除节肢动物外，还报道了对曼氏血吸虫（Schistosoma mansoni）和T. szidata尾蚴阶段的生物活性（由水溶性M外毒素介导），以及对中间宿主蜗牛Oncomelania仅在异常高浓度（≈900 ng/mL）下的影响。对根结线虫Meloidogyne incognita的影响也有描述。
这些发现表明Bti毒素在分子水平上并非完美特异性。然而，影响非靶标生物所需的条件远超出正常野外使用。实际上，这些结果定义了Bti活性的外限而非其实际影响。野外证据因此确认Bti在操作使用下的生态足迹保持狭窄、可预测和环境可管理。
5 人类与脊椎动物安全性：机制与实证证据
广泛的机制、毒理学和生态证据表明，Bt物种包括Bti对人类和脊椎动物野生动物（包括鱼类、两栖动物、鸟类、爬行动物和哺乳动物）无毒性和无致病性。这种安全性的机制基础在于根本的生理学不兼容性：Bti晶体前毒素需要高度碱性中肠条件进行溶解和蛋白水解活化，而脊椎动物消化系统为酸性并迅速降解溶解的蛋白质。脊椎动物肠上皮也缺乏Cry和Cyt介导的孔形成所需的受体环境和膜物理化学特性。
与这些限制一致，哺乳动物毒性研究即使在最大可测试剂量下也未能建立LD50值，长期饲养试验未显示致癌性、生殖性、发育性或系统性毒性的证据。这些发现 collectively 支撑了美国EPA、WHO和其他监管机构的风险评估，导致Bti被归类为适合公共卫生使用的降低风险杀幼虫剂。北美和欧洲操作应用后的大规模流行病学研究和健康监测项目报告暴露人群中无显著急性或慢性不良健康后果，偶发的轻微症状归因于制剂组分或颗粒暴露而非内在的Cry或Cyt毒性。
在哺乳动物或人类细胞系中显示细胞毒性效应的实验室研究通常依赖高度人工条件，涉及直接暴露于浓缩芽孢或更类似于蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）而非杀虫Cry或Cyt蛋白的营养生长因子。这些试验中的暴露水平远超现实环境或职业浓度，且 comparable 效应未在体内或通过流行病学监测中证明。环境归宿数据进一步支持脊椎动物安全性：Bti毒素不生物累积或生物放大，并在野外条件下降解迅速。鱼类和两栖动物毒性阈值同样高，无观察到不良效应浓度（No Observed Adverse Effect Concentration, NOAEC）值超过106芽孢/mL，LC50值高于107–108芽孢/mL，而野外应用后的环境浓度很少超过102–103芽孢/mL，并因沉积和微生物降解而迅速下降。长期监测未在处理的湿地中检测到脊椎动物种群水平的下降。
关于PILO的亲脂性Cyt1Aa1成分可能扩大宿主范围或损害生态安全性的担忧未得到现有证据支持。这是因为Cyt1Aa1通过三个关联约束在蚊和黑蝇中毒途径中保持功能受限：碱性中肠依赖性活化、对特定膜物理化学特性的依赖（大多数非双翅目分类群缺乏此特性），以及其作为膜相关替代受体增强Cry结合而不扩展分类学活性的作用。定量毒理学数据强化了这一结论：脊椎动物NOAEC和LC50值对含Cyt的Bti制剂超过环境暴露水平二至五个数量级，且在接近昆虫杀虫协同所需浓度的剂量下，无脊椎动物物种表现膜破坏或系统性毒性。
关于扩展Cyt1Aa1毒性的报告几乎完全来自使用人工膜系统（如脂质体、平面双层和去垢剂处理膜）的研究，这些系统绕过了特异性的正常生物学约束。这些试验使纯化毒素直接暴露于远高于昆虫控制所用浓度的磷脂，且缺乏活组织的关键特征如消化加工和生理膜组织。因此，观察到的膜破坏反映的是试验条件而非现实相关性。与此一致，体内研究显示通过现实途径暴露时，即使在很高浓度下也无脊椎动物不良反应。
6 治理、生态权衡与可持续部署
生态选择性与公共卫生效益之间的平衡塑造了Bti在不同监管环境下的部署方式。在高度监管的温带湿地系统（包括加利福尼亚和西欧），Bti使用强调监测指导的应用、空间精度和对观察到的非靶标效应的适应性管理。相比之下，在具有持续性蚊媒疾病负担的热带和亚热带地区，Bti因其有效性、低后勤需求和减少的对广谱化学杀虫剂的依赖而被纳入核心疾病预防工具。跨区域，治理差异反映了生态风险如何相对于疾病负担进行权衡，而非对Bti选择性或安全性的分歧。
环境持久性为Bti暴露增加了时间维度。野外研究表明，芽孢和毒素可在沉积物和腐烂植物材料中保持较长时间，导致主动治疗之外的低水平暴露。在某些情况下，重复应用可减少水生昆虫羽化和向食虫脊椎动物的能量转移，特别是在小型或连通不良的湿地中。然而，这些影响通常是适度的且依赖情境，较大或连通良好的系统显示更快的恢复和有限的长期影响。
与苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种（Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki，与Bti不同，其 targeting 鳞翅目幼虫）的比较经验说明，累积暴露即使对生物学选择性的微生物杀虫剂也能产生间接生态和进化效应，这些效应在短期或小规模应用制度下不易检测。这些累积效应通过几种机制产生：敏感非靶标分类群的渐进耗竭、跨生态系统能量通路的破坏、群落组成的改变，以及进化响应（包括多次重复暴露的非靶标分类群的物候、行为或易感性变化）。虽然这尚未成为Bti使用的主要关注点，但这种系统水平响应突显了长期、监测指导的应用在IVMP中的价值。
重要的是，虽然Bti的多毒素Cry/Cyt组成提供了强固的固有风险管理，但实验室选择和基因组研究表明持续暴露仍可减弱蚊虫易感性，突显了IVMP中持续抗性监测的必要性。因此，IVMP对Bti的长期有效性仍然 essential，整合监测导向使用、栖息地特异性靶向和补充控制策略，以最大化公共卫生影响同时保持可管理的生态权衡。
7 Bti的转化稳健性：从商业杀幼虫剂到可编程蛋白质平台
Bti在IVMP中作为蚊虫杀幼虫剂的持续全球使用反映了其PILO的结构稳定性、Cyt1Aa与Cry蛋白之间的持久协同作用（对此在操作水平上尚未出现野外抗性），以及其强安全性和有效性记录。虽然PILO在大小上与芽孢相似（~1 μm）并占据约30%的细胞体积，但PILO并不限制细胞内容量；在芽孢形成期间，Bti可形成额外的大型细胞质包含体，使功能扩展而不改变天然毒素结构。例如，产生球形赖氨酸芽孢杆菌双毒素（Tpp1Aa1/Tpp2Aa1）作为额外~1 μm包含体的重组菌株，同时维持PILO，可稳定持有三个主要内部结构：天然包含体、添加的（外源）包含体和芽孢，在细胞自溶前。该菌株对幼虫的杀灭效果比原始Bti和L. sphaericus菌株高21–32倍。Cry11B或异源几丁质酶的功能增益进一步强调了Cyt1Aa介导的协同作用的战略优势。这些特性 collectively 将Bti定位为 robust、适应性强且持久的微生物蛋白生产平台。
Bti的这种功能多样化能力反映了芽孢杆菌属更广泛的通用性，其中枯草芽孢杆菌（B. subtilis）、凝结芽孢杆菌（B. coagulans）、克劳氏芽孢杆菌（B. clausii）和地衣芽孢杆菌（B. licheniformis）等物种被广泛用作益生菌，具有记载的对肠道健康、免疫调节和病原体控制的益处。其他物种包括解淀粉芽孢杆菌（B. amyloliquefaciens）、贝莱斯芽孢杆菌（B. velezensis）和短小芽孢杆菌（B. pumilus）进一步证明了属范围内的抗菌代谢产物产生和与宿主系统相互作用的能力。相比之下，Bti仍主要局限于其生物农药角色，尽管有新兴的更广泛功能性证据。例如，肉鸡日粮中添加Bti已被证明可改善肠道结构，降低隐窝深度并增加绒毛隐窝比，而无系统性免疫激活。这些发现表明了对上皮更新和肠道稳态的局部效应，将Bti的相关性从昆虫控制扩展到肠道靶向应用和微生物生物技术。
除这些应用角色外，PILO本身代表了具有更广泛意义的、显著未被充分探索的生物学结构。它是一个自组装的多层蛋白基质，以 exceptional 致密堆积和对环境、物理及生化应激因子的高抗性为特征。其多孔、纤维状多层基质（MFM）结构暗示了Cry和Cyt蛋白组装的独特内部翻译转运机制，这在分子水平上尚未完全解析，但显然具有更广泛的应用潜力。尽管如此，其在酸性和碱性条件下的稳定性，结合对蛋白水解的抗性，突显了其作为耐用且多功能生物材料用于生物技术开发的潜力。
PILO形成与杀幼虫活性的遗传解耦可使该细胞器被重新诠释为中性的细胞内蛋白储库。Bti在芽孢形成期间积累极高蛋白负荷而不损害生存能力的能力在细菌中不寻常，概念上类似于工程蛋白纳米区室如encapsulins（~24–42 nm）和细菌微区室（~40–200 nm），尽管规模大得多。以纳米级蛋白笼约24–45倍的尺寸，PILO提供了增强的 payload 容量和延长的细胞内持久性，这些特性是有利的且难以用合成支架复制。这些特性支持以"冷链"生物分子储存和稳定化为中心的扩展应用，包括多价镶嵌黏膜疫苗。
与此一致，芽孢形成衍生的蛋白性包含体天生适应于通过休眠、干燥和环境应激保持分子完整性，为稳定不稳定酶、抗原或工业蛋白（包括重金属结合蛋白）提供了冷冻干燥或合成包封的生物学替代方案。除被动稳定化外，PILO基质的物理化学稳健性进一步支持将其作为黏膜抗原复合物递送支架的潜力审慎考虑，特别是对于抗原不稳定性、蛋白水解降解和上皮摄取低效仍是限制因素的肠道病原体。
7.1 Bti PILO作为多价抗原递送平台应用的理论框架
与传统亚单位疫苗系统（常受不稳定性、低抗原密度和低效共递送限制）不同，PILO的多层结构可使多种异源蛋白纳入单一、致密堆积的组装体中。这种多路复用 cargo 装载能力对靶向需要协调免疫响应多种毒力决定因素的复杂病原体特别有利。
在肠道细菌病原体中，基于PILO的系统可实现多样化抗原的共递送，包括不耐热肠毒素（LT）和耐热肠毒素（ST）、定居因子（如CFA/I、CS6）以及侵袭蛋白如IpaB、IpaD和鞭毛蛋白（FliC）。这些抗原反映了感染的不同阶段：黏附、毒素产生和侵袭，它们在单一基质中的联合递送可 broadening 免疫响应，同时帮助维持胃肠道转运期间的抗原稳定性。
除细菌抗原外，PILO平台还可很好适用于抗寄生虫蠕虫（helminths）的疫苗。这些疫苗依赖易失去正确结构或降解的脆弱蛋白抗原。关键例子包括曼氏血吸虫（Schistosoma mansoni）蛋白如Sm-TSP-2和Sm14，以及钙蛋白酶衍生的Sm-p80抗原。在钩虫中，重要靶标包括消化酶如Na-GST-1和Na-APR-1，这些对寄生虫生存 essential 且已在临床试验中测试。其他寄生虫抗原如蛔虫蛋白（如As16）和工程化多表位构建体进一步证明蛋白疫苗可对抗蠕虫。重要的是，蠕虫疫苗开发正日益聚焦于组合多种抗原或表位以应对寄生虫复杂性和免疫逃逸，这突显了像PILO这样可在高密度下高效包装多种蛋白的平台的需求。
PILO系统类似于其他基于颗粒的抗原平台，如诺如病毒衍生纳米颗粒（VP1 P结构域）和轮状病毒VP6结构，其中多拷贝抗原展示有助于改善免疫识别和响应。然而，PILO提供了几个关键优势：它可以包装多得多的抗原，对酶解和极端pH条件具有天然抗性，并在细菌芽孢形成期间自组装。这些特性使PILO能够创建稳定的、高密度抗原颗粒，可在肠道中持续足够时间以增强黏膜组织摄取和改善免疫激活。
重要的是，单一基于PILO的构建体中细菌、病毒和寄生虫抗原的整合 raises 了开发广泛保护性、组合黏膜疫苗的可能性。这种方法在低资源环境中可能特别有影响，那里的冷链限制、共流行感染和后勤约束需要稳定的、多病原体疫苗解决方案。通过实现多种抗原类别的同步稳定和共递送，PILO平台直接解决了历史上限制口服亚单位疫苗成功的几个关键生物学和实践障碍。
7.2 PILO基平台的工程考量与转化挑战
PILO基系统向非杀幼虫应用的转化将取决于几个关键领域的进展。这些包括删除pBtoxis中的cry和cyt基因；阐明异源蛋白在多层基质中整合和转运的机制；鉴定可被重新用作模块化 cargo 包装元素的PILO相关组分；以及评估实际考量如可扩展性和蛋白回收。在研究人员当前的工作中，研究人员开始揭示将蛋白转运入PILO所需的因素，并鉴定除Cry和Cyt外与多层基质相关的蛋白的作用。这些蛋白包括由pBtoxis编码的Bt152（PILO稳定性所需）和与encapsulin壳蛋白具有序列和结构同源性的Bt075。在PILO缺陷菌株中表达Bt075-GFP嵌合体产生低于光学显微镜分辨极限（<0.2 μm）的离散细胞内和纯化颗粒，表明Bt075确实形成encapsulin样壳。这种encapsulin样蛋白在 substantially 更大组织规模上的结构保护的明显重新利用，突显了PILO的进化复杂性，并突显了可在模块化、非杀幼虫PILO基系统设计中被利用的机制。在这方面，除将异源蛋白转运入PILO外，与MFM结合用于表面展示的Bt152和Bt075蛋白嵌合体也可能引起兴趣。此外，如果Bt075确实形成encapsulin壳，它也可独立被工程化为蛋白递送载体。
PILO的 exceptional 蛋白堆积密度表明其能力不仅限于个体 cargo 的高水平积累，还包括在单一组装体中多路并入多种不同蛋白，实现多功能或组合应用。支撑其转化相关性，Bti在约72小时内完成芽孢形成和随后的自溶，高效释放芽孢连同副芽孢包含体和任何相关重组（r）PILO组装体，这一生产周期成本高效，与许多异源蛋白表达系统相比 favorably。
尽管前景可观，若干限制和技术挑战仍有待解决。核心在于对PILO本身作为生物学细胞器的理解不完整。虽然已知 native 毒素转运入包含体发生，但 governing 蛋白靶向、整合和空间组织的具体信号序列和机制在很大程度上仍未定义。此外，PILO的详细多层结构尚未在高分辨率下解析。这种结构洞察的缺乏限制了研究人员预测关键参数的能力，如 cargo 容量、层内空间分布，以及对蛋白大小、化学计量或复杂性的潜在约束。
从工程角度，实现可预测和可控的 cargo 装载仍是主要障碍，特别是对于异源或多组分组装。虽然致密蛋白基质暗示了独特的高装载容量，但不同 cargos 如何相互作用、共组装或可能相互干扰尚未被理解。此外，自溶后完整重组包含体的回收在技术上可能具有挑战性，特别是当并入蛋白对剪切力、pH波动或下游加工条件敏感时。通过纯化、干燥和制剂保持结构完整性同样 critical，因为这些步骤可能 readily 损害蛋白组装的稳定性。
将该系统转化为工业应用引入了进一步的约束。扩大生产规模将需要 robust、标准化的工作流程，符合良好生产规范（Good Manufacturing Practice, GMP）要求，包括一致性、纯度和可重复性的严格基准。的确，虽然研究人员谨慎乐观，解决这些挑战对于 fully 实现PILO作为独特、自组装的细胞内区室具有 significant 潜力作为高密度蛋白包装和递送平台 essential。
8 结论
Bti作为蚊虫杀幼虫剂的长期成功不仅反映了其毒素库的有效性，还反映了其PILO固有的稳健性、可扩展性和可靠性。当超越其经典的杀虫角色考虑时，PILO emerges 为一种 uniquely 进化的细胞内蛋白组装系统，优化了 exceptional 高密度 cargo 积累、结构韧性和环境持久性。合成生物学和蛋白工程的最新进展提供了将PILO重新构想为可编程、自组装生物材料的机会。其致密且可能多路复用的蛋白包装能力，结合物理化学应激下的稳定性，支持在生物分子储存、酶稳定化和环境响应性递送中的应用。更推测性但仍引人注目的途径包括其作为镶嵌黏膜抗原展示支架或其他肠道靶向生物技术的开发。重要的是，支撑Bti数十年大规模媒介控制中安全性和有效性的相同生物学和生产属性，即高效的芽孢形成、天然释放系统和 established 下游处理工作流程，可能促进其向非杀幼虫应用的转化，而不损害可制造性或环境兼容性。
尽管有这些 promising 属性，关键挑战仍然存在，包括对PILO结构的不完整理解、对 cargo 整合的有限控制，以及对可扩展、GMP兼容生产系统的需求。解决这些差距对于理性设计和更广泛实施 essential。尽管如此，研究人员的初步发现表明，PILO代表的不仅仅是特化的杀虫细胞器：它是一种通用且未被充分利用的微生物平台，对转化微生物学具有 significant 潜力， extend well beyond 其在蚊虫控制中的传统角色。
