血清型1肺炎链球菌荚膜多糖的必要作用研究

《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：Investigation of the essential role of capsular polysaccharide in serotype 1 Streptococcus pneumoniae

　　

肺炎链球菌（*Streptococcus pneumoniae*）仍是全球发病率和死亡率的主要原因，尽管广泛使用了肺炎球菌结合疫苗，估计每年仍有约50万人死亡。值得注意的是，由血清型1引起的侵袭性肺炎球菌病（invasive pneumococcal disease, IPD）持续存在，并且不成比例地影响资源匮乏地区的脆弱人群，尽管该血清型已包含在现有疫苗中。血清型1表现出非典型的生物学特性，其特征是鼻咽部携带时间短且侵袭潜力高。这种表型与荚膜介导的宿主免疫逃逸有关，包括抗吞噬作用、抗补体沉积、抗调理吞噬杀伤、抗黏液捕获以及抗中性粒细胞胞外陷阱。两性离子型血清型1荚膜多糖被认为能增强穿过黏液层并进入深层组织（如嗅上皮和大脑）的能力。荚膜生物合成所需的基因位于*d**e**x**B*–*a**l**i**A*的*cps*位点内；然而，血清型1还需要该位点外的基因来参与AATGal的生物合成及其转移到十一异戊二烯基磷酸（undecaprenyl phosphate, UndP）的过程。为了阐明血清型1荚膜在致病性中的作用，研究人员对*cps*相关基因进行了遗传分析和诱变。参与荚膜生物合成和组装的基因似乎对细菌存活至关重要，因为尽管进行了多次尝试，仍无法将其破坏，而荚膜位点上不参与荚膜生物合成的其他基因（如*rlmA*）则可被成功突变。为了克服无法构建明确*cps*突变体的困难，研究人员使用了血清型2荚膜转换株（D39::*cps*1）和表达*cps*1位点的大肠杆菌（*Escherichia coli*）菌株，并构建了明确的荚膜突变体（Δ*wchB*、Δ*wchD*、Δ*gla*、Δ*ugd*）。研究人员利用这些突变体，通过FITC-葡聚糖标记和电子显微镜定量荚膜厚度，测量补体沉积和抗体结合，并在斑马鱼感染模型中评估了相对于亲本血清型1菌株519/43和D39^WT的毒力。本文报道了尽管D39::*cps*1菌株表达了血清型1荚膜并保留了关键的相关特性——包括增加的荚膜厚度和减少的抗体结合及补体沉积——但其全部毒力并未被重现。相反，与亲本血清型1菌株相比，荚膜转换株的毒力显著减弱，表明毒力并非完全依赖于荚膜。

**论文解读文章**

**研究背景**
肺炎链球菌（*Streptococcus pneumoniae*）通常作为人类共生菌定植于鼻咽部，但也是机会性病原体，可导致肺炎、脑膜炎和菌血症，给全球造成重大负担。尽管广泛使用了高效结合疫苗，该菌每年仍导致超过100万人死亡，其中约30万为5岁以下儿童。值得注意的是，由血清型1肺炎链球菌引起的侵袭性肺炎球菌病（IPD）持续存在，尤其是在资源匮乏地区和易感人群中，尽管该血清型已包含在大多数现有疫苗制剂中。目前已鉴定出超过100种肺炎球菌血清型，每种血清型在鼻咽部定植能力或导致IPD的能力上各不相同。与其他血清型不同，血清型1菌株并非是有效的无症状鼻咽部定植者，而是表现出相对较高的侵袭潜力（侵袭性）；因此，血清型1菌株的行为并不像典型的共生肺炎球菌菌株，其定植时间仅为1至2周。研究表明，定植程度与携带时间和侵袭潜力呈正相关。肺炎球菌荚膜被认为是最关键的毒力因子之一，能提供针对多种宿主防御机制的保护，包括抗吞噬作用、补体介导免疫、调理吞噬杀伤、减少中性粒细胞胞外陷阱的捕获以及限制气道黏液的捕获。血清型1荚膜多糖是唯一报道的两性离子型荚膜，可能有助于穿过黏液层到达上皮下层。此前发现血清型1荚膜对抗调理作用和补体沉积的能力显著更强，并观察到其穿过鼻咽部到达嗅觉组织最终进入脑部的增强能力。血清型1菌株表达的荚膜与其他已知血清型不同，因此需要更详细的基础分析来理解这些差异如何增强其毒力和组织嗜性。

**目前存在的问题及研究目的**
在血清型1肺炎链球菌中，荚膜组装所需的基因位于染色体上由一个保守的基因组区域（*dexB*–*aliA*边界区）内，该区域被称为*cps*位点。该位点的基因按其功能组织：上游为四个共同基因（*wzg, wzh, wzd, wze*，也称为*cpsA, cpsB, cpsC, cpsD*），下游为血清型特异性基因，编码糖基转移酶（*wchB, wchD*）和乙酰转移酶（*wchC*）。然而，与大多数血清型不同，血清型1依赖位于荚膜位点外的三个基因（*sp_0103, sp_1837, sp_1838*）来生成第一个糖（AATGal）并将其转移到脂质载体十一异戊二烯基磷酸（UndP），这些基因还参与磷壁酸和脂磷壁酸的生物合成途径。此外，血清型1还携带*ugd*和*gla*基因，分别负责合成UDP-葡糖醛酸和UDP-半乳糖醛酸。尽管已开发遗传操作工具，但血清型1菌株中荚膜生物合成基因是否可被突变尚不清楚。为了阐明血清型1荚膜在发病机制中的作用并定义所涉酶的功能，研究人员对*dexB*–*aliA*基因组区域进行了全面分析。

**主要关键技术方法**
研究人员使用了血清型1菌株519/43（来自丹麦血清研究所，1943年分离，ST5316）和BVJ1JL（来自马拉维患者，ST5012），以及血清型2菌株D39^WT。主要方法包括：通过Gibson组装构建诱变质粒转化519/43；利用自然转化在D39::*cps*1背景中构建Δ*wchB*、Δ*wchC*、Δ*ugd*、Δ*gla*突变体；通过免疫荧光显微镜和斑点印迹确认荚膜缺失；通过FITC-葡聚糖排斥法和扫描电子显微镜（SEM）半定量荚膜厚度；通过流式细胞术检测C3b沉积和人静脉注射免疫球蛋白（IVIG）结合；通过斑马鱼（*Danio rerio*）幼虫后脑室注射感染模型评估毒力。

**研究结果**

**Mutagenesis of the cps loci in S. pneumoniae serotype 1**
在519/43菌株中对*cps*位点进行诱变极为困难。尽管每个靶点尝试超过10次，但*wzg*、*wchB*、*wchC*、*wzy*、*gla*和*ugd*基因的突变均未成功。然而，位于*cps*位点内但不直接参与荚膜组装或单糖生成的基因（如*rlmA*、*rlmB*、*rlmC*、*cpsO1*和*swt00335*）可被成功突变。

**Confirmation of loss of capsule by the D39::cps1 mutants via immunofluorescence microscopy**
D39::*cps*1菌株与抗血清型1抗血清反应正常。Δ*wchB*、Δ*ugd*和Δ*gla*突变体均不与抗血清型1抗血清反应，表明完全失去荚膜。Δ*wchC*突变体呈现中间表型，54.9%的细菌与抗血清反应（n=253），表明部分乙酰化受损。

**Capsule thickness semi-quantification by FITC-dextran exclusion**
FITC-葡聚糖排斥实验显示：D39^WT与D39::*cps*1荚膜厚度无显著差异；519/43^WT荚膜厚度（466.77平方像素）显著大于D39::*cps*1（407.06平方像素）（p<0.05）。所有突变体（Δ*gla*、Δ*ugd*、Δ*wchC*、Δ*wchB*）的荚膜厚度（200-235平方像素）均显著小于野生型（p<0.0005），表明荚膜完全丢失或仅有一个连接AATGal的UndPP单位。

**Scanning electron microscopy for determination of presence/absence of cell capsule**
SEM分析显示：D39::*cps*1的荚膜厚度显著大于D39^WT（p<0.0001）。两种突变体（Δ*wchB*和Δ*wchC*）的荚膜面积均显著小于两种野生型（p<0.0001）。此外，血清型2荚膜呈“尖刺”状表面，而D39::*cps*1表达的血清型1荚膜更致密、更均匀。

**C3b deposition and IVIG**
流式细胞术结果显示：所有无荚膜突变体的C3b沉积和IVIG结合水平均显著高于有荚膜的D39^WT和D39::*cps*1菌株（p<0.05至p<0.0001）。这表明即使单个荚膜基因突变导致的严重荚膜减少或丢失，也会显著增强抗体结合和补体沉积；而有荚膜菌株（包括表达异源血清型1荚膜的D39::*cps*1）表现出降低的结合水平，符合荚膜的保护作用。

**Zebrafish infection of D39WT, D39::cps1, and D39::cps1ΔwchB**
斑马鱼幼虫后脑室感染实验显示：D39::*cps*1感染组存活率为81.4%（n=42），显著低于519/43^WT组（p<0.01）和D39^WT组（p<0.0001）。D39::*cps*1Δ*wchB*突变体感染组存活率为97.6%（n=41），显著高于D39::*cps*1组。细菌载量测定表明，D39::*cps*1和D39::*cps*1Δ*wchB*在0、24、48小时的载量无显著差异，排除了生长缺陷导致毒力降低的可能。

**讨论与结论**
讨论部分指出：血清型1荚膜基因在亲本菌株519/43中无法突变，可能因为这些基因对细菌存活至关重要，或因为荚膜生物合成中断会导致致死后果。一种可能机制是：如果荚膜重复单元未组装，UndPP-AATGal可能累积阻碍十一异戊二烯基的循环，从而影响脂磷壁酸（LTA）和壁磷壁酸（WTA）的合成；或者UndPP-AATGal被错误地用于过量的WTA和LTA合成，导致自溶。因此，血清型1中荚膜组装与细胞存活之间的关联比其他血清型更紧密。为克服这一限制，研究人员使用了D39::*cps*1荚膜转换株，成功构建了突变体。尽管D39::*cps*1表达了血清型1荚膜并增强了抗补体沉积和抗抗体结合能力，但其毒力并未增强，反而显著降低，表明毒力不完全依赖于荚膜。这强调了需要改进的分子工具（特别是基因敲低而非完全敲除）在保存细菌存活的前提下阐明该荚膜的功能。

研究结论部分翻译如下：
对血清型1荚膜合成和组装所需基因的诱变在两个测试的血清型1菌株中均未成功，提示该荚膜可能对细菌存活不可或缺。相反，当血清型1荚膜位点被引入血清型2 D39背景时，相同基因的突变成功并产生了无荚膜的等基因突变体。尽管D39能够表达血清型1荚膜，且其存在增强了抗补体沉积和抗体结合的能力，但并未增加毒力。相反，D39::*cps*1菌株的毒力相较于D39^WT和519/43^WT菌株均显著降低。总之，这些发现表明血清型1荚膜在肺炎球菌存活和发病机制中的作用比预期的更复杂。关键在于，这凸显了对改进分子工具的需求——特别是能够实现基因敲低而非完全敲除的方法——这对于在保持细菌存活的前提下全面阐明该荚膜的功能至关重要。此外，推进认识需要使用定植或鼻腔内感染模型来评估D39::*cps*1穿过鼻黏膜并促进肺炎和/或菌血症发展的能力。